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【摘要】目的分離得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法采用選擇性培養(yǎng)基從農(nóng)藥廠的污泥中進(jìn)行富集和分離篩選高效菌株，并且用16SrDNA序列分析法和其生理生化特征對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)，命名為Klebsiellasp.J2（登錄號為AY989899），菌株J2能以氯氰菊酯為唯一碳源進(jìn)行生長，降解氯氰菊酯的最適溫度是35℃,最佳pH是7.0。結(jié)論菌株J2是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株。

【關(guān)鍵詞】氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解

Abstract:ObjectiveToisolateabacterialstrainJ2capableofdegradingcypermethrinfromsludgeofapesticidemanufacturer.MethodsAdoptingselectiveculturetoscreenandisolatethecypermethrindegradingstrainfromthesamplesandidentifyingthestrainbyusingthe16SrDNAsequenceanalysisanditstaxonomiccharacteristics.ResultsThisbacterialstrainwasidentifiedasKlebsiellasp.namedJ2.Itcouldgrowwithcypermethrinassolesourceofcarbon.TheoptimaltemperatureandpHofcypermethrindegradationbytheorganismwere35℃and7.0.ConclusionThebacterialstrainJ2effectivelydegradecypermethrin.

Keywords:cypermethrin；Klebsiellasp.J2；biodegradation

隨著20世紀(jì)80年代無機(jī)鹽農(nóng)藥和有機(jī)氯農(nóng)藥的相繼禁用，菊酯類農(nóng)藥已發(fā)展為我國現(xiàn)階段使用最廣泛的農(nóng)藥之一，由于具有廣譜、內(nèi)吸、觸殺等高效殺蟲特性，因此廣受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者歡迎。但是，大量使用引起的農(nóng)藥殘留不僅造成環(huán)境與食品的污染，而且影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量及人們的身體健康。農(nóng)藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學(xué)降解和光降解等方式。與其他的降解方式相比，微生物降解具有操作簡單、降解徹底、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此利用微生物技術(shù)處理農(nóng)藥殘留，并對受污染的土壤與水體進(jìn)行生物修復(fù)是一種行之有效的方法。目前對有機(jī)磷和有機(jī)氯等農(nóng)藥的微生物降解的研究比較多，而關(guān)于菊酯類農(nóng)藥的降解研究較少。本文從農(nóng)藥廠的污泥中采集土壤樣品，篩選分離到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J2），并對其進(jìn)行篩選、鑒定及降解性能的初步研究［13］。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g、NaCl2.0g、KH2PO41.5g、葡萄糖1.0g、dH2O1000mL，pH值7.0；經(jīng)115℃，滅菌20min。基本培養(yǎng)基（1L）：NH4Cl1.0g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl0.5g，加入氯氰菊酯作為唯一碳源，濃度視需要添加。LB液體培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，pH值7.0（固體加2%的瓊脂粉）。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

氯氰菊酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）原藥和標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，色譜純）購自成都化學(xué)試劑公司；TaqDNA聚合酶與各種限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物；3SDNAGelPurificationkitV3.1購自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亞合成；pMD18T載體試劑盒購自大連寶生物。

1.3降解菌株的富集和分離

將采集的農(nóng)藥污染土樣配制成15%的懸浮液，以5%的接種量接到含25mg/L氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基中，并加適量玻璃珠，37℃、160r/min振蕩培養(yǎng)。待菌長出后，取1mL菌液接入同樣培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，傳代過程中氯氰菊酯的濃度逐步增高至300mg/L,大約2d傳代1次。將富集的農(nóng)藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）稀釋，分別取0.2mL懸液涂布在含有50mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；當(dāng)平板出現(xiàn)菌落時(shí)，將單菌落在無機(jī)鹽農(nóng)藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長快、菌落規(guī)則、傳代穩(wěn)定的單菌落斜面保存。將初篩純化的斜面單菌落接入含有50mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基,37℃、160r/min培養(yǎng)2d，測定其降解率。

1.4菌株的鑒定

菌株的形態(tài)及生理生化特性參照文獻(xiàn)［4,5］進(jìn)行，并采用bioMerieuxVitek全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，菌株16SrDNA的克隆及序列測定和比較參照文獻(xiàn)［6］，提取J2的基因組DNA作為模板，進(jìn)行菌株J2的16SrDNA擴(kuò)增，PCR引物分別為：引物1：5’AGACTTTGATCCTGGCTCAG—3’；引物2：5’CGGCTACCTTGTTACGACTTC3’；25μL的體系為：模板DNA1μL，25mmol/LdNTP1μL，上、下游引物各1μL，10×擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）2.5μL，Taq酶（5U/μL）0.51μL，ddH2O18μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃延伸8min。用PCR回收試劑盒回收16SrDN段并連接到T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；挑選白斑菌落進(jìn)行插入片段的酶切驗(yàn)證；測序由上海博亞公司完成。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上通過blastn軟件與GeneBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性分析比較。

1.5氯氰菊酯含量的測定［7-9］

采用氣相色譜法，取培養(yǎng)液3mL，移入10mL具塞刻度試管，分別加入5mL的石油醚，劇烈震蕩10min，靜置2h，重復(fù)2次，取上層有機(jī)相加入無水硫酸鈉吸水，并定容，再用氣相色譜儀（VARIANCP3800）檢測。檢測條件：檢測器為FID，柱HP5（30m×0.25mm×0.25μm），柱溫采用程序升溫，起始溫度150℃，以30℃/min升溫至250℃，保持15min，載氣為氮?dú)猓w積分?jǐn)?shù)99.999%）,流量為40mL/min，進(jìn)樣量為0.8μL,FID檢測器溫度290℃，進(jìn)樣口溫度260℃，分流比為50。氯氰菊酯的降解率按下式計(jì)算：降解率=對照樣品殘留量－處理樣品殘留量對照樣品殘留量其中，對照為不接降解菌或不加降解酶的同樣反應(yīng)體系。

1.6菌株培養(yǎng)

從4℃保存的J2菌株斜面接一環(huán)于LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)10h左右，以此為種子液（OD600控制在1.5左右，下同）。菌體生長量的測定：準(zhǔn)確量取10mL培養(yǎng)菌液于已稱重的EP管中,4℃,10000r/min離心10min,用無菌dH2O洗滌2次,小心去上清,所得的菌體在85℃烘烤箱中烘至恒重，電子分析天平稱重。

2結(jié)果

2.1高效降解菌的分離和篩選

采集樣品3份，經(jīng)富集和馴化，將樣品稀釋后涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，選擇平板上共篩選到7株細(xì)菌。將這7株細(xì)菌分別接種于含有50mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h后，測定氯氰菊酯的降解率，其中菌株J2對氯氰菊酯的降解率最高(94.2%),見表1。

表1分離的細(xì)菌菌株對氯氰菊酯的降解率略

2.2高效降解菌株的初步鑒定

該降解菌株屬革蘭陰性菌，兼性厭氧菌，呈球桿狀，單個(gè)或短鏈狀排列，長0.9～1.2μm,寬2.1～2.5μm，不形成芽孢，有莢膜。在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌落直徑為0.5mm，呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實(shí)驗(yàn)呈陰性；VP反應(yīng)顯陽性；三糖鐵瓊脂試驗(yàn)不產(chǎn)生H2S；其他生理生化特性見表2。

2.3菌株16SrDNA的序列分析

以菌株J2的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1514bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1），測序后在GenBank上登錄，登錄號為AY989899。根據(jù)同源性比較，菌株J2與Genebank中的Klebsiellapneumoniaestrain2(登錄號為DQ444287.1)和Klebsiellapneumoniaestrainmcp11d(登錄號為EF419182.1)的同源性為99%。因此根據(jù)以上形態(tài)特征和生理生化特性,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)［10］以及16SrDNA序列同源性比較結(jié)果,將菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.),命名為Klebsiellasp.J2。

表2分離株J2的部分生理生化特性略

圖1菌株J2的16SrDNA略

2.4氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入氯氰菊酯，使其終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400mg/L。按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復(fù)3次,37℃下160r/min培養(yǎng)2d，取樣10mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖2。從圖2可知，當(dāng)氯氰菊酯濃度低于200mg/L時(shí)，菌株Klebsiellasp.J2可以對氯氰菊酯進(jìn)行降解；同時(shí)，隨著氯氰菊酯濃度的提高，其生長也逐步提高，在200mg/L時(shí)達(dá)到最大值；而當(dāng)氯氰菊酯濃度超過250mg/L時(shí)，菌株Klebsiellasp.J2細(xì)胞由于受到氯氰菊酯毒性的作用，菌體的生長受到抑制，因此，菌株的生長和對氯氰菊酯的降解隨之下降，到400mg/L時(shí)基本不能生長，降解率也趨于零。

圖2氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響略

2.5溫度對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響

按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種于內(nèi)含100mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃下160r/min培養(yǎng)2d,每個(gè)處理重復(fù)3次，分別取樣10mL，測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖3。從圖3可知，在25～45℃之間，菌株Klebsiellasp.J2生長和降解氯氰菊酯的效果較好，其中以35℃時(shí)最佳，氯氰菊酯降解率達(dá)95.21%；在25℃以下及45℃以上時(shí)，菌體生長較慢，氯氰菊酯降解率有不同程度的下降。

圖3溫度對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響略

2.6pH對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響

測定pH在5.0-10.0之間對菌株降解率的影響。分別配制pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液和甘氨酸氫氧化鈉緩沖液，加入NaNO3、KCl滅菌，冷卻后合并，分開滅菌的CaCl2、MgSO4·7H2O，使用前加入100mg/L的氯氰菊酯。按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復(fù)3次,37℃下160r/min培養(yǎng)2d后，取樣10mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結(jié)果見圖4。從圖4可知，在pH5.5-7.5之間，菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能比較好，最適pH為7.0，降解率為96.11%。

圖4pH對菌株Klebsiellasp.J2的生長和降解效能的影響略

2.7菌株Klebsiellasp.J2的降解底物譜研究

按種子培養(yǎng)液2%的接種量接種于含100mg/L不同菊酯類農(nóng)藥和1%葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,于37℃下160r/min培養(yǎng)2d后,取樣10mL測定菌體生物量和不同菊酯類農(nóng)藥的降解率，結(jié)果見表3。從表3可知,菌株Klebsiellasp.J2對各種菊酯類農(nóng)藥都有比較好的降解能力,特別是對氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明顯,而對氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯的降解作用則不明顯。

表3菌株Klebsiellasp.J2的降解底物譜研究略

3結(jié)論

通過富集培養(yǎng)從農(nóng)藥廠的污泥中分離到一株能以氯氰菊酯為唯一碳源生長且能將其高效降解的細(xì)菌，經(jīng)生理生化試驗(yàn)及16SrDNA初步鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.),命名為Klebsiellasp.J2;對降解菌Klebsiellasp.J2的生長和降解條件進(jìn)行了初步的研究，該菌株降解氯氰菊酯的最適溫度是35℃,最佳pH是7.0;降解菌Klebsiellasp.J2還能降解甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯等多種菊酯類農(nóng)藥。

4討論

為了分離特定農(nóng)藥的降解菌，富集時(shí)以這種農(nóng)藥為唯一碳源和能源，只添加必要的無機(jī)鹽，在特定生長條件下（即在某一選擇壓力下）長期培養(yǎng)微生物，在此條件下生長并且占優(yōu)勢的微生物一定能夠分解利用此條件中的營養(yǎng)物質(zhì)。按照這一原理設(shè)計(jì)富集培養(yǎng)基，從長期受菊酯農(nóng)藥污染的土壤中采集樣品，以此富集培養(yǎng)基連續(xù)富集馴化，在此培養(yǎng)基中生長的微生物即能利用氯氰菊酯作為碳源進(jìn)行生長，并在培養(yǎng)環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢。

本文初步分析了不同的外界條件對菌株的降解效能的影響。結(jié)果表明，菌株對這些條件都有一個(gè)適宜的適應(yīng)范圍，在此范圍內(nèi)具有較好的降解力，超出了這個(gè)范圍，菌株的降解效能就受到影響。不同的條件具有不同的效果，這可能是由菌株的生理結(jié)構(gòu)及特性所決定的。因此在降解菌的開發(fā)利用過程中，應(yīng)該綜合考慮到這些因素的影響，并合理利用，以充分發(fā)揮菌株的降解效能。

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