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【摘要】目的探討血紅素氧合酶-1（ho-1）對汞引起腎細胞凋亡的影響及其可能的機制。方法64只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組、單純染汞組、HO-1誘導組和HO-1抑制組，每組16只。先分別腹腔注射生理鹽水、空白液、血晶素、鋅原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）預處理，8h后處死各組內半數鼠取腎查HO-1表達水平與活性，余鼠除對照組注射生理鹽水外，其余3組均腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1），24h后檢測血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）及腎內總抗氧化能力（TAOC）、丙二醛（MDA）、Bcl-2蛋白表達水平與細胞凋亡指數（AI）。結果與對照組比較，單純染汞組TAOC降低而MDA、Cr、BUN、Bcl-2表達水平和AI均明顯增加（P<0.01），HO-1抑制組除Bcl-2表達受抑外，其余指標的變化與單純染汞組相似，但更為顯著。HO-1誘導組與單純染汞組及HO-1抑制組比較，TAOC及Bcl-2表達均顯著升高，而MDA、Cr、BUN及AI則明顯降低（均P<0.01）。結論HO-1通過抗氧化、上調Bcl-2蛋白表達水平而對抗汞引起腎細胞凋亡的作用。

【關鍵詞】血紅素氧合酶-1;腎;汞;凋亡;大鼠

氯化汞（HgCl2）是一種腎毒性藥物，常用于制作急性腎功能衰竭的動物模型。近年研究揭示，汞能促進細胞線粒體產生大量H2O2等活性氧，后者進一步誘導的細胞凋亡在汞所致的急性腎衰中起著重要作用［1-2］。血紅素氧合酶-1（HO-1）是一種抗氧化酶，廣泛參與各種組織細胞應對氧化應激時的防御機制，是機體拮抗氧化應激損傷最重要的內源性保護物質，但HO-1能否抑制汞介導的腎細胞凋亡及急性腎損傷罕見報道。為此，我們擬應用血晶素與鋅原卟啉Ⅸ（Zn-PPⅨ）分別特異性誘導與抑制HO-1，以探明HO-1對HgCl2引起大鼠腎細胞凋亡的影響及其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

血晶素、ZnPPⅨ為Sigma公司產品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆HO-1IgG抗體及Bcl-2IgG抗體、SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑等均購自武漢博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋亡檢測試劑盒購于Boehringer公司，其它試劑均為分析純。

1.2動物分組與標本采集

選用健康雄性Wistar大鼠64只（體重250～310g），隨機分為4組:對照組、單純染汞組、HO-1誘導組和HO-1抑制組，每組16只。預先分別給各組大鼠腹腔注射等量生理鹽水、空白液（由0.1mmol·L-1NaOH和0.1mmol·L-1PBS液按體積比1∶24配制而成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30mg·kg-1）及ZnPPⅨ（20mg·kg-1），8h后，每組均任挑8只處死，取腎臟，一部分腎置于4%的中性甲醛液中固定作HO-1免疫組化染色，其余部分于-80℃保存待測HO-1活性。余鼠除對照組經腹腔注射等量生理鹽水外，其余3組均經腹腔注射HgCl2（2mg·kg-1）溶液，動物自由進食飲水，24h后各組大鼠經2%戌巴比妥鈉40mg·kg-1腹腔注射麻醉，開腹經下腔靜脈抽血檢測肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出腎臟，取部分腎組織置于4%的中性甲醛液中固定，剩余腎組織于-80℃保存待測各項生化指標。

1.3免疫組化檢測

取上述甲醛液固定腎組織，常規(guī)石蠟包埋切片（厚6μm），二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，于1g·L-1TBS中微波修復抗原10min，再置于3%H2O2中15min，滅活內源性酶，PBS液反復沖洗3次，采用SABC法按試劑盒說明書分別滴加HO-1或Bcl-2抗體（抗體滴度均為1∶200），DAB顯色，封片，400倍鏡下隨機選擇5個不重疊視野觀察腎小管上皮細胞，胞漿見棕色顆粒者為陽性染色細胞。HO-1蛋白表達量采用CD-8病理彩色圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度值表示，Bcl-2蛋白表達量采用陽性染色指數（PI）表示，PI（%）=陽性染色細胞數/視野內所有細胞數×100%。

1.4生化指標檢測

血Cr、BUN分別采用苦味酸法和二乙酰法，按試劑盒說明書測定。腎組織TAOC和MDA采用化學比色法，操作按試劑盒說明書進行。另取各腎組織標本約0.5g，加蔗糖Tris緩沖液制成組織勻漿，差速離心法分離微粒體，考馬亮藍法測定蛋白濃度，根據HO-1降解血紅素生成膽紅素的原理，參照何潔［3］的方法測定HO-1活性，以1mg蛋白1h催化血紅紅蛋白降解生成膽紅素的量表示腎組織HO-1活性（nmol·mg-1·h-1）。

1.5TUNEL法檢測細胞凋亡

腎組織經4%中性甲醛液固定過夜，脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚6μm），置于包被有多聚賴氨酸的載玻片上，嚴格按試劑盒說明書進行操作，最后用蘇木素復染細胞核，400倍光鏡下觀察，胞核染成棕黃色者為凋亡細胞，每張切片選10個不重疊視野，每個視野連續(xù)計數100個腎小管上皮細胞，以凋亡細胞所占的百分比作為凋亡指數（AI）。

1.6統(tǒng)計學分析

所得數據均為計量資料，以x-±s表示，組間比較采用F及q檢驗，應用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。

2結果

2.1腎組織內HO-1蛋白表達與活性

免疫組化染色顯示，僅HO-1誘導組出現HO-1明顯表達，主要定位于腎小管上皮細胞的胞漿中，表現為腎小管上皮細胞胞漿普遍被染成棕褐色，對應的HO-1活性也顯著升高。而其余3組腎內HO-1表達較少，染色極淺，對應的HO-1活性也較低，其中HO-1抑制組HO-1活性顯著降低。組間比較見表1。表1各組HO-1蛋白表達與活性水平比較（略）

2.2腎組織及血生化指標檢測結果

與對照組比較，單純染汞組及HO-1抑制組TAOC降低而MDA、Cr、BUN均明顯升高，HO-1誘導組則TAOC明顯升高（P<0.01），MDA、Cr、BUN雖有升高趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）。與單純染汞組比較，HO-1誘導組TAOC明顯升高，而MDA、Cr、BUN均顯著下降，HO-1抑制組則相反，TAOC明顯下降，而MDA、Cr、BUN均顯著升高。HO-1誘導組與HO-1抑制組間各指標均有顯著性差異（均P<0.01）。見表2。表2各組血生化檢測結果比較（略）

2.3Bcl-2蛋白表達

對照組腎內幾乎不表達Bcl-2，單純染汞組Bcl-2陽性染色細胞在近曲小管較常見，遠曲小管相對較少，HO-1誘導組腎小管Bcl-2陽性染色細胞顯著增多，而HO-1抑制組腎小管Bcl-2陽性染色細胞則較少，各組間比較見表3。表3各組Bcl-2蛋白表達及細胞凋亡情況比較（略）

2.4細胞凋亡檢測結果

對照組腎內凋亡細胞數少見。單純染汞組見凋亡細胞，主要為近曲小管上皮細胞出現凋亡，與之相比較，HO-1誘導組細胞凋亡明顯減少，而HO-1抑制組細胞凋亡則顯著增多，組間比較見表3。

3討論

腎臟是無機汞攻擊的主要靶器官，但汞致腎損傷的確切分子機制尚未完全闡明。已有研究顯示，給予HgCl2能夠顯著增加腎內H2O2等活性氧生成［4］，降低腎內重要抗氧化劑谷胱甘肽的含量，并降低腎內超氧化物歧化酶的活力，同時生成過量的脂質過氧化產物丙二醛［5-6］。當給予外源性抗氧化劑或自由基清除劑，則可明顯減輕HgCl2所致的腎損傷，從而提示促氧化應激是汞致急性腎損傷的重要機制［5］，進一步研究發(fā)現，活性氧除直接引起生物膜脂質過氧化導致細胞不可逆損傷外，還可通過激活P38MAPK等多途徑介導細胞凋亡［7］。本研究結果也顯示，單純染汞組較對照組腎內TAOC顯著降低，MDA生成增多，出現腎小管上皮細胞凋亡增加和腎功能降低，從而證實了HgCl2的氧化應激性腎損傷機制。HO-1是近年倍受重視的細胞內源性抗氧化酶，本質上屬于應激蛋白，能在各種氧化應激狀態(tài)下出現適應性表達，發(fā)揮抗氧化等多種細胞保護作用。HO-1的抗氧化性源于其對促氧化的游離血紅素的降解及生成具有強大抗氧化能力的膽紅素，后者能非特異性清除多種自由基［8］。本研究結果顯示，預先應用血晶素誘導HO-1蛋白表達及活性升高后，可明顯升高腎組織TAOC，降低MDA生成，抑制細胞凋亡并改善腎功能，而預先抑制HO-1蛋白的活性，則會加重汞所致的氧化應激損傷，增加細胞凋亡并使腎功能惡化，從而支持抗氧化作用是HO-1抗汞所致細胞凋亡和腎功能損傷的重要機制。

曹秉振等［9］報道，汞可能通過下調Bcl-2蛋白表達、激活caspase-3，從而引起大鼠小腦顆粒細胞凋亡。本研究中，我們也對腎組織內Bcl-2的變化作了檢測，結果顯示，預先誘導HO-1蛋白表達可以顯著上調腎內Bcl-2表達，反之，抑制HO-1表達則下調Bcl-2表達水平。Bcl-2是迄今發(fā)現最重要的抗凋亡蛋白之一，主要通過抑制Bax的促凋亡作用、維持細胞鈣穩(wěn)定、抑制細胞色素C進入細胞漿等，最終抑制由凋亡蛋白酶（caspase）激活所介導的細胞凋亡［10］。因此，HO-1上調Bcl-2表達水平可能是其抗汞致腎細胞凋亡的另一重要機制，至于HO-1如何上調Bcl-2表達尚不清楚。文獻資料提示，HO-1通過降解血紅素生成的另一重要產物CO可能是其抗細胞凋亡作用的重要執(zhí)行者［11］。

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