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摘要:從木瓜中提取､分離､鑒定齊墩果酸｡方法:采取回流法､索氏提取法和冷浸法從木瓜中提取齊墩果酸,然后采用酸堿沉降法､氯仿萃取法分離純化,并用高效液相色譜法進(jìn)行鑒定｡結(jié)果:結(jié)果顯示回流法提取效果最好｡結(jié)論:為齊墩果酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)｡

關(guān)鍵詞:木瓜;齊墩果酸;提取;分離;高效液相色譜法

0前言

木瓜,又稱皺皮木瓜,鐵腳犁,酸木瓜等,為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的果實(shí)｡木瓜是具有食用,藥用觀賞的多用途植物,果實(shí)成熟后,色澤金黃,氣味芳香,果實(shí)營(yíng)養(yǎng)極為豐富｡齊墩果酸(Oleanolicacid),分子式為C30H48O3,是木瓜的主要有效成分,別名土當(dāng)歸酸,大部分以游離酸或糖苷的形式存在,為五環(huán)三萜類化合物,是我國(guó)首次從植物中發(fā)掘出來(lái)的,是治療急性黃疸型肝炎和慢性病毒性肝炎比較理想的藥物｡

本實(shí)驗(yàn)以干木瓜為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化提取齊墩果酸的最佳工藝條件｡通過(guò)酸堿沉降或氯仿萃取的方法分離純化,最后經(jīng)高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行鑒定｡該種方法準(zhǔn)確可靠,為初步研究建始木瓜中齊墩果酸提供試驗(yàn)基礎(chǔ),為齊墩果酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)｡

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)原料

干木瓜片,粉碎機(jī)粉碎

1.1.2試驗(yàn)的主要儀器和設(shè)備

HHS型電熱恒溫水浴鍋,RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,722可見(jiàn)分光光度計(jì),紫外分光光度計(jì),電子天平,分析天平,液相設(shè)備,分析柱:HypersilODS25μm｡

1.1.3試驗(yàn)主要試劑

95%工業(yè)酒精,分析醇的95%乙醇､甲醇､冰醋酸､高氯酸､濃硫酸､乙酸乙酯､香草醛,齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品｡

1.2方法

1.2.1齊墩果酸提取方法的比較

(1)回流提取法:稱取木瓜粉25g,分別用100ml,80ml,70ml的95%工業(yè)酒精在60℃下回流提取,時(shí)間依次為4,3,2小時(shí),合并提取液,用乙醇定容至250ml,作為供試樣｡

(2)索氏提取法:稱取木瓜粉25g,用95%工業(yè)酒精在索氏提取器中提取,在90℃下至虹吸下溶液近無(wú)色(約8小時(shí)),將提取液轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶,定容至刻度作為供試樣｡

(3)冷浸提取法:稱取木瓜粉25g,用95%工業(yè)酒精150ml浸提一周,再用100ml乙醇浸提5天,合并浸提液,將提取液轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶,定容至刻度作為供試樣｡

1.2.2比色法測(cè)定齊墩果酸的含量

精密稱取香草醛0.3g,用移液管加入6ml冰醋酸,配置成5%香草醛-冰醋酸溶液｡分別取回流法,索氏提取法和冷浸法提取的樣品0.01ml(每種做3個(gè)平行)加入試管中,加熱揮發(fā)溶劑,試劑空白為對(duì)照｡精密加入新制的香草醛-冰醋酸0.2ml和高氯酸0.8ml,在70℃恒溫水浴加熱15分鐘｡流水冷卻至室溫,精密加入乙酸乙酯4ml,搖勻,在波長(zhǎng)560nm處測(cè)定吸光值,比較三種方法提取率｡

1.2.3回流提取的單因素實(shí)驗(yàn)

(1)溫度對(duì)提取率的影響:分別稱取10g木瓜粉,以95%工業(yè)酒精,料液比為1:15,按40,50,60,70,80℃五個(gè)溫度梯度提取9h,提取3次,合并提取液,定容至250ml｡分別取0.01ml提取液加入試管中,通過(guò)比色法測(cè)定齊墩果酸的含量(每個(gè)樣品3個(gè)平行)｡

(2)時(shí)間對(duì)提取率的影響:分別稱取10g木瓜粉,以95%工業(yè)酒精,料液比為1:15,按3h,5h,7h,9h,11h五個(gè)時(shí)間梯度,置于60℃水浴鍋,提取3次,時(shí)間間隔分別為1.5,1,0.5h;2.5,1.5,1h;3,2.5,1.5h;4,3,2h;4.5,3.5,3h｡合并提取液,定容至250ml｡分別取0.01ml提取液加入試管中,通過(guò)比色法測(cè)定齊墩果酸的含量(每個(gè)樣品3個(gè)平行)｡

(3)料液比對(duì)提取率的影響:按料液比為1:5,1:10,1:15,1:20,1:25,以95%工業(yè)酒精,置于60℃水浴鍋中9h,提取3次,每次的溶劑用量為25,15,10ml;50,30,20ml;70,50,30ml;90,70,40ml;100,80,70ml｡合并提取液,定容至250ml｡分別取0.01ml提取液加入試管中,通過(guò)比色法測(cè)定齊墩果酸的含量(每個(gè)樣品3個(gè)平行)｡

1.2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化回流提取的工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,考察溫度(A),提取時(shí)間(B),料液比(C)3個(gè)因素,每個(gè)因素3個(gè)水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)｡因素-水平表見(jiàn)表1-1所示｡

1.2.5齊墩果酸的分離純化

(1)酸堿沉降法:準(zhǔn)確稱取4gNaOH固體,加入100ml水,配成1mol/ml的NaOH溶液｡量取10ml濃硫酸,將其緩慢倒入90ml水中,配成10%硫酸溶液｡取一份回流供試樣將其旋轉(zhuǎn)真空濃縮,濃縮成浸膏狀物,回收乙醇,浸膏狀物質(zhì)用1mol/lNaOH溶液煮40分鐘,趁熱過(guò)濾,重復(fù)3次,合并濾液｡用10%硫酸溶液調(diào)pH=1,沸水浴4小時(shí),氯仿萃取｡蒸餾回收氯仿,得固體齊墩果酸用甲醇定容至100ml｡

(2)氯仿萃取法:取一份回流供試樣將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮成浸膏狀物,回收乙醇,所得浸膏狀物質(zhì)先后用水和氯仿洗滌,合并洗滌液,去水層,有機(jī)層用水洗滌6次,去水層,蒸餾氯仿,所得齊墩果酸用甲醇定容至100ml

1.2.6齊墩果酸的HPLC鑒定

(1)色譜條件:色譜柱為ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,流動(dòng)相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1｡

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取10mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇溶解,置于10ml帶刻度的試管中,配成1mg/ml的對(duì)照品溶液｡

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:用取樣槍準(zhǔn)確吸取0.1ml,0.2ml,0.3ml,0.4ml,0.5ml對(duì)照品溶液,加甲醇補(bǔ)充至10ml,混合均勻,得到濃度為0.01mg/ml,0.02mg/ml,0.03mg/ml,0.04mg/ml,0.05mg/ml的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液｡每次取20μl進(jìn)樣,測(cè)定其峰面積｡以齊墩果酸濃度(x)和峰面積(y)求回歸方程｡

(4)精密度測(cè)定:取上述對(duì)照品20μl,重復(fù)5次進(jìn)樣,測(cè)定各自峰面積｡

(5)重復(fù)性實(shí)驗(yàn):取同一樣品平行制備5份供試品溶液,在上述同樣色譜條件下分別進(jìn)樣20μl,測(cè)定其峰面積｡

(6)加樣回收實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)確量取已知含量的齊墩果酸樣品溶液1ml,加入0.2mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品,做5個(gè)平行,在上述色譜條件下分別進(jìn)樣20μl,測(cè)定其峰面積｡

2結(jié)果與分析

2.1提取方法的比較

木瓜中齊墩果酸的提取法主要有回流提取法,索氏提取法,冷浸提取法等方法,三種提取方法中,回流提取的效果明顯好于其他兩種方法,索氏提取所需溫度在80℃以上,可能會(huì)對(duì)齊墩果酸的結(jié)構(gòu)造成破壞,而冷浸則提取溫度相對(duì)較低,提取不完全,故而這兩種方法的提取率低于回流法提取｡因此,本研究采用回流提取法進(jìn)行下一步試驗(yàn),并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝｡

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1溫度對(duì)提取率的影響?yīng)?/p>

為了選擇正交試驗(yàn)合適的溫度條件,用95%的工業(yè)酒精,在相同的提取時(shí)間,料液比的條件下,對(duì)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn),其提取率的變化情況在40℃-70℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,分子的活性增大,擴(kuò)散速度加快,浸出速度也加快,因此提取率升高,在70℃處為最大值,但是80℃時(shí)提取率有所下降,一方面可能是由于溫度過(guò)高對(duì)齊墩果酸的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,另一方面則可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高引起乙醇的揮發(fā),造成溶劑損失｡因此選定50℃,60℃,70℃作為正交試驗(yàn)的溫度因素的三個(gè)水平｡2.2.2時(shí)間對(duì)提取率的影響?yīng)?/p>

在相同的提取溫度,料液比的條件下分別控制不同的提取時(shí)間,考察提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響｡其提取率的變化情況顯示:提取時(shí)間短則齊墩果酸來(lái)不及溶出,提取率較低,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),木瓜中齊墩果酸的提取率逐漸增高,其增長(zhǎng)率分別為94.9%,9.5%,8.4%,1.7%｡由此可以看出,5h以后提取率的增長(zhǎng)逐漸趨于緩和｡提取時(shí)間的延長(zhǎng)雖然可以提高提取率,但是長(zhǎng)時(shí)間的提取雜質(zhì)的溶出率也會(huì)相應(yīng)升高｡因此從經(jīng)濟(jì)高效等原因考慮,為節(jié)約時(shí)間､降低能耗,選擇5h,7h,9h作為正交試驗(yàn)中時(shí)間因素的三個(gè)水平｡

2.2.3料液比對(duì)提取率的影響?yīng)?/p>

在相同的提取溫度,時(shí)間的條件下,分別選取不同的料液比,考察其對(duì)提取效果的影響｡其提取率的變化情況顯示,

隨著料液比的升高,由于溶劑的量的增加,其提取率也相應(yīng)的不斷增加,增長(zhǎng)率分別為73.9%,37.7%,60.4%,4.9%｡由此可以看出,當(dāng)料液比達(dá)到1∶20以后,提取率的上升趨勢(shì)逐漸趨于平緩｡在實(shí)驗(yàn)條件范圍之內(nèi),料液比1∶25時(shí)為最大提取率｡但是料液比不宜過(guò)多,否則不僅浪費(fèi)溶劑,而且增加濃縮工作量｡因此選擇1∶5,1∶20,1∶25作為正交試驗(yàn)料液比因素的三個(gè)水平｡

2.3正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

以乙醇為溶劑的三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2-1,對(duì)表中齊墩果酸的提取率進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2-2｡正交實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的結(jié)果表明,溫度,時(shí)間,料液比對(duì)提取率影響的大小為溫度>時(shí)間>料液比｡木瓜中齊墩果酸的最佳提取條件為A3B3C3即:溫度70℃,提取時(shí)間9h,料液比1∶25｡

2.4高效液相色譜法鑒定齊墩果酸

用外標(biāo)法對(duì)進(jìn)行定量分析,標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品與回流提取純化樣品對(duì)比的HPLC圖譜分別見(jiàn)圖1､2､3｡經(jīng)計(jì)算得木瓜中齊墩果酸的含量為1.28mg/g｡

色譜條件:ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

色譜條件:ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2:氯仿萃取純化樣品

色譜條件:ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1

1:齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2:酸堿沉降純化樣品

2.4.1線性關(guān)系考察

如圖4所示,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到回歸方程y=4099733x+22375,r2=0.9918,結(jié)果表明齊墩果酸在0.01-0.05mglml與峰面積呈良好的線性關(guān)系｡

色譜條件:ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm流動(dòng)相為甲醇:水:乙酸=90:10:0.1

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)

用標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次,每次進(jìn)樣20ìl,齊墩果酸峰面積值RSD為2.23%<5%,精密度良好｡

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品平行制備5份供試品溶液,在上述同樣色譜條件下分別進(jìn)樣20ìl,測(cè)定其峰面積,所得RSD值為3.45%<5%,靈敏度良好｡

2.4.4加樣回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取1.28mg/g的齊墩果酸樣品溶液1ml,加入0.2mg的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品,做5個(gè)平行,測(cè)定其峰面積,經(jīng)計(jì)算其平均加樣回收率為97.8%,準(zhǔn)確度良好

3討論

3.1關(guān)于提取

有報(bào)道用氯仿,甲醇作為提取溶劑,本實(shí)驗(yàn)所選用的溶劑為95%工業(yè)酒精｡在這三種提取方法中,索氏提取與回流法都需要加熱,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相差不大,但回流法的實(shí)驗(yàn)條件更易于控制,冷浸法不需要加熱,但是花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)｡

3.2關(guān)于比色法測(cè)含量

可以與齊墩果酸發(fā)生顯色反應(yīng)的試劑有十余種,資料表明用這些試劑顯色,都可進(jìn)行齊墩果酸比色測(cè)定｡但經(jīng)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用香草醛-濃硫酸試劑顯色,雖然吸光值較大,但是除試劑空白顏色較深外,更主要的是穩(wěn)定性差,甚至同時(shí)做的平行試樣,時(shí)間稍有不同吸光值就有變化｡因此,本實(shí)驗(yàn)選用香草醛-高氯酸為顯色劑｡用此方法顯色時(shí)應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題:①水分對(duì)測(cè)定有干擾,因此容器必須充分干燥;②提取的樣品在揮去溶劑時(shí)不能過(guò)熱,否則齊墩果酸的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞,這樣會(huì)影響測(cè)定結(jié)果;③5%香草醛-冰醋酸溶液必須臨用前新鮮配制,否則顯色靈敏度會(huì)下降,這可能與香草醛易于被空氣中的氧氧化有關(guān);④香草醛和冰醋酸都容易揮發(fā),因此加樣時(shí)動(dòng)作要迅速｡

3.3關(guān)于高效液相色譜法鑒定齊墩果酸

在色譜條件的建立過(guò)程中,開(kāi)始使選擇了80%的甲醇作為流動(dòng)相,但是實(shí)驗(yàn)圖譜顯示并沒(méi)有將齊墩果酸分離出來(lái),之后在甲醇中添加了1%的冰醋酸,取得了較好的分離效果｡在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,最終確定了甲醇∶水∶冰醋酸=90∶10∶0.1為流動(dòng)相,保留時(shí)間在7min左右｡需要注意的是,流動(dòng)相配制好后應(yīng)混合均勻,否則會(huì)對(duì)保留時(shí)間有所影響｡經(jīng)過(guò)對(duì)齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的紫外掃描,確定了215nm為檢測(cè)波長(zhǎng)｡

3.4關(guān)于發(fā)展前景

齊墩果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜,人工合成步驟繁多,目前仍依賴從植物中提取得到,雖然借助越來(lái)越先進(jìn)的技術(shù)和越來(lái)越精密的儀器,今后人工合成的比例會(huì)越來(lái)越大,但由于從植物中提取得到的齊墩果酸為天然藥物,對(duì)人體無(wú)任何毒副作用,加之齊墩果酸在植物中分布較廣,藥源比較豐富,在天然藥物開(kāi)發(fā)利用已成為世界潮流的今天,齊墩果酸提取的前景仍很廣闊｡

4結(jié)論

(1)通過(guò)不同提取方法的比較,選定回流提取為本研究的提取方法｡

(2)木瓜中齊墩果酸的回流提取最佳工藝條件為溫度70℃,提取時(shí)間9h,料液比1∶25｡

(3)分離純化后進(jìn)行HPLC鑒定,建立的色譜條件為ODSC18色譜柱,柱溫25℃,流速1ml/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)215nm,流動(dòng)相為甲醇∶水∶乙酸=90∶10∶0.1｡測(cè)得干木瓜中齊墩果酸的含量為1.28mg/g,該方法操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確度高｡

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