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【摘要】目的研究石榴(PunicagranatumL.)皮提取物對紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用。方法采用3種活性氧產(chǎn)生體系誘發(fā)脂質(zhì)過氧化為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停O(shè)立模型對照組（MC）、正常對照組（NC）以及3個(gè)石榴皮提取物給藥組，觀察比較各組的丙二醛（MDA）含量。結(jié)果同MC組相比，三組石榴皮提取物對黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、H2O2及UV照射3種方法引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的生成增加均有抑制作用，且有一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論石榴皮對自由基引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】石榴；紅細(xì)胞膜；脂質(zhì)過氧化

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofpomegranatepericarps(PunicagranatumL.)onlipidperoxidationdamageoferythrocytemembrane.MethodsModeloflipidperoxidationoferythrocytemembranewasmadebythreekindsofradicalsgenerationsystems，xanthine（Xan）xanthineoxidase(XO)system,H2O2,andUVlight.Observationwasmadeonthecontentofmalondialdehyde(MDA).ResultsComparedwithMCgroup,theincreasesofMDAcontentinthemembraneinducedbyXanXOsystem,H2O2orUVlightinallofthethreePunicagranatumL.groupwereinhibiteddosedependently.ConclusionPunicagranatumL.mayprotecterythrocytemembranefromthelipidperoxidativedamageinducedbyradicals.

Keywords:PunicagranatumL;erythrocytemembrane;lipidperoxidation

脂質(zhì)過氧化發(fā)生在需氧細(xì)胞中，是分子態(tài)的氧與不飽和脂肪酸作用的過程；自由基被證明廣泛地參與脂質(zhì)過氧化過程。細(xì)胞膜因富含飽和脂肪酸最易受自由基攻擊，自由基對細(xì)胞膜的損傷主要是產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而影響甚至損傷機(jī)體的功能而引起一系列疾病。如有報(bào)道指明活性氧自由基與哮喘、發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、帕金森綜合征、唐氏癥、癡呆等疾病的發(fā)生有關(guān)［1］。自由基清除劑作為抗氧化劑，可以防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，從而預(yù)防機(jī)體因自由基產(chǎn)生的病變。許多陸生植物的次級代謝產(chǎn)物都可以作為抗氧化劑，特別是帶有酚羥基的物質(zhì)，如黃酮、鞣質(zhì)、香豆素等［2,3］。

石榴(PunicagranatumL.)是我國已知的最早的可食用的植物之一，在我國被廣泛的種植。我國5個(gè)最有影響的石榴產(chǎn)區(qū)分別是：山西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四川會理、云南蒙自。石榴皮是石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木石榴的干燥果皮，在中藥中它被用來治療痢疾、細(xì)菌感染、腹瀉、寄生蟲病及出血等疾病。近來又有報(bào)道指出石榴皮還有殺精子［4］及抗淋球菌的作用［5］。因?yàn)槭衿ぶ兄饕绪焚|(zhì)，占總質(zhì)量的10.4%～21.3%，多酚類化合物已被證明具有清除自由基的作用，所以石榴皮可能具有清除自由基而抗氧化的作用。

本實(shí)驗(yàn)用2種方法研究不同鞣質(zhì)含量的石榴皮提取物對大鼠紅細(xì)胞膜氧化損傷的保護(hù)作用。脂質(zhì)過氧化物可分解產(chǎn)生丙二醛（MDA），本實(shí)驗(yàn)用MDA的量來衡量脂質(zhì)過氧化的程度。實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)不同濃度的給藥組來研究抗氧化性和劑量的效應(yīng)關(guān)系。

1材料

UV2800紫外分光光度計(jì)（Unico上海儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（3K30Sigma公司）；冷凍干燥機(jī)（ChristALPHA14）；大白兔，武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2003-0004；石榴皮（購自武漢市藥材公司，經(jīng)武漢大學(xué)藥學(xué)院張洪教授鑒定為石榴科石榴屬石榴的果皮）；黃嘌呤（Xan）和黃嘌呤氧化酶（XO）（Sigma公司）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)藥物的制備

稱取一定量石榴皮，粉碎，用3倍量的70％的丙酮在室溫下浸漬約6h，再超聲30min，濾取濾液。其殘?jiān)僦貜?fù)以上操作3次，將濾液合并，濃縮，冷凍干燥，制成粉末。

2.2紅細(xì)胞膜的制備

兔全血在0～4℃用低滲溶血法制備［6］，膜蛋白含量用考馬斯亮蘭試劑盒測定，得膜蛋白濃度0.7778g/L。

2.3XanXO體系誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化

反應(yīng)終體積為1.0mL。各取制得的紅細(xì)胞膜0.5mL，分別加待測藥物0.1mL（MC和NC組加pH7.4磷酸鹽緩沖液），置37℃水浴15min，再加1.0mmoL/L的Xan溶液0.3mL，0.4U/mL的XO0.1mL,立即將反應(yīng)管置37℃水浴1h待測。對照組、空白組、0.3mg/mL劑量組、0.5mg/mL劑量組、1mg/mL劑量組都分別檢測12次。

2.4UV照射誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化

反應(yīng)終體積為1mL，內(nèi)含細(xì)胞膜0.5mL及不同濃度的藥物0.1mL（MC和NC組用pH7.4磷酸鹽緩沖液代替），再加入0.4mLpH7.4的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)管置紫外燈下照射1h后待測（MC組在同樣溫度下靜置而不放在紫外燈下）。對照組、空白組、0.3mg/mL劑量組、0.5mg/mL劑量組、1mg/mL劑量組都分別檢測12次。

2.5脂質(zhì)過氧化物的檢測

采用MDA試劑盒測定,測定過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）含量以反映脂質(zhì)過氧化程度。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

MDA數(shù)值采用±s表示，多組資料間的兩兩比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性。

3結(jié)果

3.1石榴皮對XanXO體系誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

圖1顯示，與對照組比較，0.3mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5mg/mL、1mg/mL的劑量組的P值<0.01,說明石榴皮對XanXO體系誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA的生成有明顯的抑制作用。

(*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

圖1石榴皮對XanXO體系誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響（略）

Fig.1EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyXanXOsystem

3.2石榴皮對H2O2誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

圖2顯示，與對照組比較，0.3mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5mg/mL、1mg/mL劑量組的P值<0.01,說明石榴皮對H2O2誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA的生成有明顯的抑制作用。

(*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

圖2石榴皮對H2O2誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響（略）

Fig.2EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyH2O2system

3.3石榴皮對紫外線（UVlight）誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

圖3顯示，與對照組比較，0.3mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的劑量組的P值均<0.01,說明石榴皮對紫外線（UVlight）誘導(dǎo)兔血紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA的形成有明顯的抑制作用。

(*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

圖3石榴皮對UVlight誘導(dǎo)兔紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響（略）

Fig.3EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyUVlight

4討論

氧自由基可多方面氧化細(xì)胞，如細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白及DNA。因?yàn)榧?xì)胞膜由脂質(zhì)雙分子層組成，所以細(xì)胞膜很容易被氧自由基攻擊而發(fā)生過氧化。這些過氧化過程會產(chǎn)生很多的產(chǎn)物，如乙醛、過氧化氫及自由基等。

脂質(zhì)過氧化過程會造成細(xì)胞膜的損傷［7］，從而會對細(xì)胞的生命活動造成直接的損害。除此之外，過氧化物分解產(chǎn)物還會和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生次級反應(yīng)，進(jìn)一步損傷機(jī)體，可使DNA發(fā)生變異等［8，9］。脂質(zhì)過氧化物是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，其含量與自由基的濃度成正比。脂質(zhì)過氧化物（LPO）在稀酸中加熱降解為丙二醛（MDA），MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在532nm處有最大吸收峰。本試驗(yàn)采用的MDA試劑盒可以準(zhǔn)確地反映出亞細(xì)胞水平的脂質(zhì)過氧化量［10］。

本實(shí)驗(yàn)為了觀察石榴皮提取液及其凍干粉對抗細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的作用，采用了2種誘導(dǎo)氧化損傷體系，分別通過不同的機(jī)制產(chǎn)生自由基：在XanXO系統(tǒng)中，Xan在XO的催化下產(chǎn)生了超氧陰離子自由基（O2-·）：Xan+2O2+H2O→尿酸＋O2-＋2H+。近年有學(xué)者應(yīng)用電子順磁共振（ERS）技術(shù)檢測到該體系有O2-·生成；而紫外線照射可使細(xì)胞膜懸液中的H2O2、O2和其它生物分子中的電子從低能軌道躍遷到高能軌道，稱為激發(fā)態(tài)分子，后者迅速分解成·OH、O2-·和生物分子自由基。本實(shí)驗(yàn)采用的2個(gè)損傷體系［11］中產(chǎn)生的自由基種類和損傷機(jī)制是有一定差異的，但石榴皮均能抑制脂質(zhì)過氧化的形成，說明它們的保護(hù)機(jī)制是多途徑的，是非特異性的自由基清除劑，其確切機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)顯示，石榴皮提取液及其凍干粉可以顯著抑制MDA的生成，這表明它們有阻止自由基生成或是清除自由基的作用。從而進(jìn)一步表明石榴皮提取物有抗氧化和保護(hù)細(xì)胞膜的作用。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，石榴皮提取物凍干粉較提取液有更強(qiáng)的抗氧化活性。這可能是因?yàn)閮龈煞壑械镊焚|(zhì)含量較高的原因，而鞣質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)中是主要的抗氧化活性物質(zhì)。但也不排除黃酮這種也有抗氧化的物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生正面影響。

本研究結(jié)果可能對由自由基引起的疾病的治療有一定的積極作用。石榴皮對自由基的作用，從本實(shí)驗(yàn)看來并不是特異性的，所以還需要通過更多的動物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究石榴皮的抗氧化活性。

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