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【摘要】目的探討蘆薈大黃素苷與dna的相互作用。方法采用電子吸收光譜，熒光發(fā)射光譜，粘度實(shí)驗(yàn)以及凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。結(jié)果與結(jié)論蘆薈大黃素以插入方式與DNA分子結(jié)合；較高濃度的蘆薈大黃素苷能夠使Bel7402肝癌細(xì)胞DNA由超螺旋構(gòu)型轉(zhuǎn)化為缺刻構(gòu)型。

【關(guān)鍵詞】蘆薈大黃素苷；分子識別；凝膠電泳；DNA

Abstract:ThebindingpropertiesofbarbalointoDNAwereinvestigatedbyUVvisibleelectronabsorptionspectrum,fluorescenceemissionspectrum,viscositymeasurementandgelelectrophoresis,andinsertionofbarbalointoDNAwasidentified.HigherconcentrationofbarbaloincouldconvertDNAconfigurationofhepatomacarcinomacellBel7402fromsuperhelixtoindention.

Keywords:barbaloin;molecularrecognition;DNA

蘆薈是一種傳統(tǒng)的常用中藥，用于治療如燒傷、燙傷等疾病并被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品等行業(yè)，并被。蘆薈大黃素苷(圖1)是蘆薈塊莖的主要成分,異蘆薈大黃素苷是植物中的主要存在形式，通過非酶催化轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素苷，因此通常得到的是蘆薈大黃素苷和異蘆薈大黃素苷的混合物［1，2］。蘆薈的抗菌、抗炎、抗氧化作用等與蘆薈大黃素苷的存在密切相關(guān)［3，4］。在生物體內(nèi)蘆薈大黃素苷通過代謝轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素而發(fā)揮藥理作用［5，6］。

圖1蘆薈大黃素苷和異蘆薈大黃素苷的分子結(jié)構(gòu)（略）

Fig.1Themolecularstructureofbarbaloinandisobarbaloin

近年來的研究表明，蘆薈大黃素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［7-12］。研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能促進(jìn)人早幼粒HL60白血病細(xì)胞P27基因過度表達(dá)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［13］。一般認(rèn)為DNA是抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)之一［14］。藥物分子可以通過共價(jià)結(jié)合、插入作用、溝結(jié)合方式或靜電結(jié)合方式與DNA分子締合，對DNA的構(gòu)象產(chǎn)生微擾，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

本文采用熒光光譜和流體力學(xué)方法研究了蘆薈大黃素苷與DNA分子的締合機(jī)理。結(jié)果表明蘆薈大黃素苷能夠以插入方式與DNA分子結(jié)合；凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光照下蘆薈大黃素苷能夠使Bel7402肝癌細(xì)胞DNA的超螺旋構(gòu)型發(fā)生一定程度的轉(zhuǎn)化。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

蘆薈大黃素苷由中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院陸偉剛博士提供;Bel7402肝癌細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤研究所提供。所用化學(xué)試劑均為分析純，除非另有說明，所有試劑未作任何處理。蘆薈大黃素苷用5mmol/LTrisHCl,50mmol/LNaCl(pH=7.2)緩沖溶液配制。小牛胸腺DNA（華美公司）；電泳級瓊脂糖（Promega公司）。MPS2000型紫外可見光譜計(jì)（Shimadzu）；RF2000型熒光分光光度計(jì)（Shimadzu）；烏氏粘度計(jì)；DYYⅢ4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Bel7402肝癌細(xì)胞的提取

按文獻(xiàn)方法［15］進(jìn)行：收集培養(yǎng)好的Bel7402腫瘤細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液洗滌,14000r/min離心5min，收集底部白色固體沉淀，重復(fù)3次,加入RNaseA（20mg/mL）50μL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS20μL，56℃孵育2h,然后加入蛋白酶K（20mg/mL）35μL，37℃孵育24h,加入10mol/LNH4OAc150μL和無水乙醇1.2mL，20℃過夜，得到DNA的溶液，離心、干燥后，將DNA溶解在150μLTrisHCl緩沖溶液中。

1.2.2紫外-可見吸收光譜實(shí)驗(yàn)

在參比池和樣品池中分別加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，當(dāng)蘆薈大黃素苷的電子吸收光譜不再變化，此時(shí)吸收滴定達(dá)到飽和。

1.2.3熒光光譜實(shí)驗(yàn)

在樣品池中加入一定體積的蘆薈大黃素苷溶液，每次往池中加入一定體積的DNA，直至熒光光譜不再變化。

1.2.4粘度實(shí)驗(yàn)

在(25±0.1)℃恒溫水浴中使用烏氏粘度計(jì)測量。DNA的流出時(shí)間用數(shù)字秒表測量得到，每個(gè)樣品測量3次，取3次測量的平均值，以(η/η0)1/3蘆薈大黃素苷的濃度作圖［16］。

η=t-t0

η:DNA的粘度；t:DNA溶液的流出時(shí)間；t0:緩沖溶液的流出時(shí)間；η0:沒有加入蘆薈大黃素苷時(shí)DNA的粘度。

1.2.5電泳實(shí)驗(yàn)

TBE緩沖溶液中、1％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行，電泳電壓30V，電泳40min，溴乙錠染色，照相。

2結(jié)果與討論

2.1DNA對蘆薈大黃素苷電子吸收光譜的影響

電子吸收光譜是研究小分子化合物與生物大分子相互作用的常用方法之一。室溫下TrisHCl(pH=7.2)緩沖溶液中，蘆薈大黃素苷在300～400nm之間有一個(gè)強(qiáng)的ππ*躍遷，其電子吸收峰的最大值為359nm。當(dāng)向溶液中加入小牛胸腺DNA以后，蘆薈大黃素苷的電子吸收光譜出現(xiàn)明顯減色效應(yīng)，其電子吸收降低約5％(Δλ＝1nm)，見圖2。

圖2蘆薈大黃素苷與DNA作用的紫外可見光譜變化圖（略）

Fig.2TheelectronicspectraofbarbaloinintheabsenceandinpresenceofCTDNA

2.2DNA對蘆薈大黃素苷熒光發(fā)射光譜的影響

室溫下，TrisHCl緩沖溶液中，當(dāng)用260nm波長激發(fā)，蘆薈大黃素苷在360～440nm之間有一個(gè)熒光發(fā)射峰，其熒光發(fā)射峰的最大位置在372nm。當(dāng)向溶液中加入小牛胸腺DNA后，蘆薈大黃素苷的熒光發(fā)射峰明顯增強(qiáng)，見圖3。這可能是蘆薈大黃素與DNA分子結(jié)合后，由于DNA雙螺旋鏈具有疏水性作用，能夠保護(hù)蘆薈大黃素分子不受水分子的淬滅作用。

圖3蘆薈大黃素苷與DNA作用的熒光發(fā)射光譜變化圖（略）

Fig.3TheemissionspectraofbarbaloininabsenceandinpresenceofCTDNA

2.3蘆薈大黃素苷對DNA粘度的影響

當(dāng)小分子化合物與DNA分子作用后，由于其作用模式的不同，對DNA的粘度將產(chǎn)生不同的影響。一般來說，當(dāng)化合物以插入方式與DNA分子作用后，由于化合物分子嵌入到DNA的堿基對中，使DNA雙螺旋鏈拉張，將導(dǎo)致DNA的粘度上升；而以溝面結(jié)合方式與DNA作用的化合物，由于使DNA雙螺旋鏈發(fā)生不同程度的折疊和扭曲，將使其粘度下降；以靜電作用方式與DNA分子結(jié)合的化合物，對其粘度的影響則出現(xiàn)無規(guī)律的變化。蘆薈大黃素苷對小牛胸腺DNA的粘度的影響見圖4。從圖中可以看到，當(dāng)DNA溶液中加入蘆薈大黃素苷后，DNA的粘度明顯增強(qiáng)，表明蘆薈大黃素苷是以插入方式與DNA分子結(jié)合。

圖4DNA溶液粘度變化圖（略）

Fig.4TheviscosityofCTDNAinpresenceofbarbaloin.EB(▲)；barbaloin(■)

2.4蘆薈大黃素苷對Bel7402肝癌細(xì)胞DNA的光裂解作用

一般來說，不同構(gòu)型DNA在電場中遷移速率不同。具有超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子由于結(jié)構(gòu)緊密，在電場中遷移速率最快，而缺刻構(gòu)型的DNA破壞了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，在電場中的遷移速率最慢，線性構(gòu)型DNA分子在電場中遷移的速率居于兩者之間。蘆薈大黃素苷對Bel7402肝癌細(xì)胞DNA的影響見圖5。從圖中可見，當(dāng)體系中未加入蘆薈大黃素苷時(shí)(Lane1),Bel7402肝癌細(xì)胞DNA主要是以超螺旋構(gòu)型存在(FormI)；當(dāng)向體系中加入低濃度的蘆薈大黃素(Lane2-4),Bel7402肝癌細(xì)胞DNA構(gòu)型無明顯變化；但是在高濃度蘆薈大黃素作用下(Lane5),Bel7402肝癌細(xì)胞DNA構(gòu)型發(fā)生變化，其缺刻構(gòu)型（FormⅡ）的比例明顯增加，表明蘆薈大黃素以插入方式嵌入到Bel7402肝癌細(xì)胞DNA中。

1.DNA2.DNA+蘆薈大黃素(25μmol/L)3.DNA+蘆薈大黃素(50μmol/L)4.DNA+蘆薈大黃素(75μmol/L)5.DNA+蘆薈大黃素(100μmol/L)

圖5磷酸緩沖溶液(pH7.4)中蘆薈大黃素對Bel7402旰癌細(xì)胞DNA的光裂解作用（略）

Fig.5ElectrophorogramoflivercancercellsBel7402DNAinabsenceandinpresenceofbarbaloininphosphatebuffer(pH7.4)solutions

3結(jié)論

以上研究表明，蘆薈大黃素能夠以插入方式與Bel7402肝癌細(xì)胞DNA分子發(fā)生契合。契合以后，蘆薈大黃素分子對Bel7402肝癌細(xì)胞DNA分子的結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生微擾，并使其由超螺旋構(gòu)型向缺刻構(gòu)型轉(zhuǎn)化，這可能是蘆薈大黃素具有抗腫瘤作用的一個(gè)原因。

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