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本文作者：程襯襯淮穩(wěn)霞姚艷霞趙文霞作者單位：中國林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所

櫟樹猝死病菌Phytophthoraramorum是一種危害性極大的病原菌，隸屬于藻界Chromista，卵菌門Oomycota，卵菌綱Oomycetes，霜霉目Peronospora-les，霜霉科Peronosporaceae，疫霉屬Phytophthora。其寄主范圍十分廣泛，危害多種林木和花卉，造成櫟樹和石櫟等樹木死亡以及杜鵑、莢蒾等花卉枝葉枯萎。病菌最早于1993年在德國和荷蘭有枯萎癥狀的杜鵑花和莢蒾分離得到。1995年美國加利福尼亞州櫟樹大面積死亡，分離到的病原菌，經(jīng)生物學(xué)和核酸分析研究證明，這2種菌為同一種疫霉。由于疫霉多分離于土壤和水流中，很少在木本植物枝干上分離得到，2001年由歐洲學(xué)者將其定名為P．ramorumsp．nov．［1］，即“枝干上的疫霉”。該病菌因在美國引起櫟樹等樹木突然死亡(SuddenOakDeath，簡稱SOD)而聞名，故常常稱為櫟樹猝死病菌。病害在美國櫟樹和石櫟樹上的暴發(fā)，致使加州中部沿海的幾個城市和郊區(qū)森林公園中的成千上萬株樹木短時間內(nèi)迅速枯死，引起了世界各國廣泛的關(guān)注和警惕［2］。

1病原菌生物學(xué)性狀

1．1病原菌交配型

Phytophthoraramorum為異宗配合型真菌，具有兩種交配型Al和A2，只有當(dāng)Al和A2交配型共同培養(yǎng)才能完成有性生殖［1，3］。以往交配型的測定是通過交配型已知的菌株與待測菌株雜交以觀察其性器官的形成。這種方法比較耗費(fèi)時間而且不是非常可靠，一方面有些菌株并不在培養(yǎng)基里交配，另一方面，只有少數(shù)菌株測定了交配型?；赑．ramorum交配型基因的分子診斷測定方法還沒有取得進(jìn)展，因?yàn)檫@些疫霉屬的基因很少被了解，并沒有被克隆或者測序［4］。但是，北美洲以及歐洲種群的線粒體基因型看起來能充分區(qū)分兩種交配型，因?yàn)樗械腅U1世系都是A1交配型(少部分例外)，而NA1和NA2世系均為A2交配型。BoutetXetal．通過致病性分析表明，EU1×EU1交配產(chǎn)生的單卵孢株之間具有較大的變異性，超過50%的后代對杜鵑花葉片的侵染能力要小于親本，然而EU1×NA1交配后代和它們的親本之間卻沒有明顯的差異［5］。Brasieretal．研究表明，兩種交配型具有相同的寄主范圍，同一種菌株對不同寄主的致病力似乎是相同的［6］。

1．2病原菌無性系

無性系是指單一基因型的所有無性繁殖個體［7］，無性系對于P．ramorum種群生物學(xué)十分重要。無性系描述需要進(jìn)行大量的基因標(biāo)記，主要包括交配型(A1或A2)標(biāo)記、同功酶基因型標(biāo)記和DNA指紋標(biāo)記。P．ramorum變異性較大，嚴(yán)重限制了種群基因型研究。利用交配型標(biāo)記、無性基因標(biāo)記和生物化學(xué)標(biāo)記為P．ramorum種群研究提供可靠且持續(xù)的依據(jù)。Elliotetal．利用PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)研究確定了P．ramorum種群由3種無性系組成:一種源自歐洲(EU1)，另外兩種源自美國(分別為NA1和NA2)［8］。最初的交配研究表明，所有的EU1世系都是A1交配型，而NA1和NA2世系均為A2交配型［1，9］。但自2003年以來，歐洲發(fā)現(xiàn)了A2型菌株［10］，美國也發(fā)現(xiàn)了A1型菌株［11－12］，這表明了不同交配型之間雜交的潛力。無性系之間的區(qū)別不僅表現(xiàn)在交配型上，在形態(tài)學(xué)［13］、侵染力［9］、保守基因的核苷酸序列［14］以及遺傳多樣性［15－16］方面都存在差異。但是這些世系是古已有之還是近代人為原因造成的并不清楚。為了解這3種世系的進(jìn)化歷史以及它們之間的關(guān)系，Gossetal．分析了一段具有5個細(xì)胞核突變位點(diǎn)的DNA序列，發(fā)現(xiàn)同一世系內(nèi)的菌株之間并沒有區(qū)別［17］。聯(lián)合多種研究方法分析表明，3種世系大約已經(jīng)進(jìn)化了有16.5萬～50萬年的歷史?；蛑邪?種世系歷史性重組的鮮明特征，表明P．ramorum的祖先是通過有性生殖完成繁衍的。3種世系的基因差異很大，表明它們并不是通過單一的雜交繁殖種群產(chǎn)生的。相反，3種世系更可能來自3種不同的地理位置，它們在進(jìn)入北美洲和歐洲之前各自獨(dú)立進(jìn)化。

1．3病原菌培養(yǎng)

陰冷潮濕的環(huán)境對病原菌的生長有利，特別是當(dāng)葉片及樹皮表面出現(xiàn)水膜時更有利于菌絲的生長［18］。病原菌生長的最適溫度為20℃，在15～25℃的條件下均能正常生長;－1℃時病菌生長緩慢，－9℃時仍可存活;當(dāng)外界溫度超過30℃時，菌絲即停止生長:但是如果病原菌在陰冷的雨季侵入寄主，30℃的非持續(xù)氣溫下病害仍然發(fā)生［1，10，19］。

2傳播方式

P．ramorum可以產(chǎn)生厚垣孢子和游動孢子。游動孢子具鞭毛，可以自由游動。孢子可借助風(fēng)力在空氣中近距離傳播，亦可借助雨水噴濺到易感植物上面，或者通過河流傳播到較遠(yuǎn)的地方;遠(yuǎn)距離傳播則主要是借助人類活動和寄主植物調(diào)運(yùn)以及進(jìn)出口貿(mào)易［20］。

3分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)在P．ramorum研究中的應(yīng)用

作為形態(tài)學(xué)鑒定的輔助，分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法檢測P．ramorum的技術(shù)亦層出不窮，主要包括基于核糖體ITS片段和線粒體基因片段的傳統(tǒng)PCR方法，PCR-SSCP技術(shù)，PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)，ELISA法，巢氏PCR法，以及微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)等等。

多數(shù)研究表明，以美國農(nóng)業(yè)部動植物檢疫局推薦的巢式PCR技術(shù)和歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EP-PO)推薦的熒光PCR技術(shù)最為成熟可靠。一般來說，ELISA法具有相對較高的通量，可以減少樣品的使用量。ELISA法可以用來篩選所有的疫霉屬，但僅僅能鑒定到屬，而不能達(dá)到鑒定到種的水平［21］，可以作為檢測的第一階段，以便PCR技術(shù)的進(jìn)一步施行。

Hayden等運(yùn)用SYBRGreenI核酸染料，以ITS片段為基礎(chǔ)，利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)檢測出了P．ramorum［22］。Hughes等對這一方法改進(jìn)，發(fā)明了一種特殊的儀器(SmartCycler)，可以在野外使用［23］。

Bilodeau等以ITS、β微管蛋白和隱地蛋白等片段為基礎(chǔ)，利用TaqMan探針和SYBRGreenI核酸染料檢測出了P．ramorum［24］。但是較多研究表明，利用核糖體的ITS區(qū)域不能準(zhǔn)確區(qū)分P．ramorum與其相近的疫霉屬以及P．ramorum的3種世系［22，25－26］。由于線粒體基因Cox1在基因組里顯示出高拷貝數(shù)，與單拷貝基因相比，它提供了一個較大的目標(biāo)集中區(qū)，而且它在P．ramorum的3種世系間的片段是不同的［14－15，27］，所以被較多的運(yùn)用到分子生物學(xué)的研究中。ElliottM等利用基于Cox1基因的PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)確立北美和歐洲P．ramorum種群的3種世系，他們首先利用ApoI把P．ramorum從其他種群里分離出來，把EU1世系從北美洲種群里分離出來，然后利用AvaI區(qū)分NA1和NA2的基因型［8］。

伴隨著線粒體DNA序列的測序成功，利用實(shí)時熒光PCR技術(shù)來檢測P．ramorum的技術(shù)發(fā)展越來越快。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，實(shí)時熒光PCR技術(shù)具有更高的敏感性和更強(qiáng)的特異性。TooleyPW等利用線粒體基因片段結(jié)合此技術(shù)鑒別了P．ramorum和P．pseudosyringae(一種在意大利發(fā)現(xiàn)的新種)［18］。實(shí)時熒光PCR技術(shù)可以非常迅速地檢測來自野外的少量樣品，通過序列來區(qū)分菌株，因?yàn)橥瑯哟笮〉臉悠冯m然在序列上有輕微的差異，但它們的解鏈溫度并不一致［28－29］。更簡單的方法例如PCR-RFLP技術(shù)和巢氏PCR技術(shù)可以在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并且不需要很專業(yè)的設(shè)備。IvorsKL等利用RFLP技術(shù)表明在北美洲種群里，一個單一的無性系占據(jù)主導(dǎo)地位，而歐洲的種群則是由一列獨(dú)特而緊密聯(lián)系的RFLP類型組成的。同時，他們還分析了3條基因片段(ITS，coxII，nad5)的序列，結(jié)果表明所有的P．ramorum菌株的這3段序列都是相同的，系統(tǒng)發(fā)育分析表明P．ramorum與P．lateralis及P．hibernalis親緣關(guān)系最近［16］。IvorsKL等通過研究發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞州苗圃里的病原菌基因多樣性比森林里的高一些［15－16］。

在P．ramorum世系中，高變量微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被證明可以調(diào)查其種群結(jié)構(gòu)。微衛(wèi)星作為共顯性標(biāo)記最突出的特點(diǎn)是可以呈現(xiàn)出較高的變異性，從而被頻繁地應(yīng)用于種群基因結(jié)構(gòu)的研究中。但是對于無性繁殖的生物體來說，多變微衛(wèi)星位點(diǎn)的識別仍然鮮有研究。

IvorsK等［16］和ProsperoS等［30］分別設(shè)計(jì)了12對和10對微衛(wèi)星標(biāo)記，但只有少數(shù)在NA1世系中展現(xiàn)出極強(qiáng)的變異性。IvorsK等在美國森林的種群里沒有發(fā)現(xiàn)變異，而ProsperoS等于2001至2004年間分別在俄勒岡州的一片獨(dú)立森林的固定樣點(diǎn)以及俄勒岡州的苗圃里采集分析了292個病原菌種群的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在俄勒岡州的森林和苗圃之間缺乏基因交流，而且森林里的基因多樣性較低，在這4a里，森林里的多基因座基因型是非常普遍的，每年也會出現(xiàn)低層次的基因型。

BoutetX等利用微衛(wèi)星分析發(fā)現(xiàn)交配后代呈現(xiàn)出基因重新排列的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象要么是兩種親本(EU1×NA1)的等位基因重組，要么是在由雜合性向純合性轉(zhuǎn)移的過程中導(dǎo)致某一親本的等位基因的缺失(EU1×EU1)［5］。

MascherettiS等利用minimum-spanningnet-work方法分析了這些多基因座遺傳型(MGs)，發(fā)現(xiàn)一般的較常見的基因型分布在中間，而特殊的個體分散在各個枝端，這些特征與隨著本地進(jìn)化而進(jìn)化的少數(shù)普通基因型的集群現(xiàn)象相符合。他們還利用分子變異分析和空間自相關(guān)分析研究了病原菌的起源和現(xiàn)今的基因結(jié)構(gòu)，并利用一段非常小的樣本量分析了病原菌潛在的傳播方式［31］。

近年來，科學(xué)家們利用基于微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的分子分析方法證實(shí)，分布在北美洲和歐洲的3種世系(EU1、NA1、NA2)分別簇集在3支獨(dú)立的進(jìn)化枝上［15，27，32］。第1支(EU1世系)包括歐洲分布的唯一無性系以及偶爾發(fā)現(xiàn)于北美洲苗圃，第2支(NA1世系)主要是分布在北美洲森林和苗圃的世系，第3支(NA2世系)僅存在于加利福尼亞州以及華盛頓州的少數(shù)苗圃里。

4P．ramorum對生態(tài)環(huán)境的影響

P．ramorum對生態(tài)環(huán)境的影響不僅體現(xiàn)在直接致死樹木上，還有許多間接影響。RizzoD等指出，許多很嚴(yán)重的影響并不會在短期內(nèi)體現(xiàn)出來，而是一個長期的過程［33］。一些研究案例已經(jīng)體現(xiàn)出短期的間接影響。WaringK等研究發(fā)現(xiàn)，密花石櫟的致病死亡可以間接導(dǎo)致周圍紅杉林的生長速率增加［34］。也有很多研究根據(jù)現(xiàn)今的觀測數(shù)據(jù)和重建技術(shù)證明了短期影響并推測出了未來狀況，例如，RamageB等利用此方法調(diào)查了P．ramorum對紅杉林特有構(gòu)型的影響［35］。P．ramorum對生態(tài)環(huán)境的長遠(yuǎn)影響也可以從經(jīng)歷過林木死亡慘重地區(qū)的再生模式推測出來?，F(xiàn)今的再生模式需要考慮哪些樹種可以取病地區(qū)的密花石櫟，過渡期對發(fā)病的森林來說很重要，尤其是那些樹種多樣性很低的森林類型(比如紅杉林)。RamageB等綜合調(diào)查了受P．ramorum影響的森林再生過程，發(fā)現(xiàn)在密花石櫟死亡的地區(qū)，并沒有其它闊葉樹種可以替代密花石櫟。另外，某些受害嚴(yán)重的地塊缺乏足夠的樹種占據(jù)可利用的生長空間。他們在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了不適當(dāng)?shù)脑偕Ｊ剑钸m當(dāng)?shù)脑偕Ｊ讲]有顯現(xiàn)［36］。需要注意的是，此研究僅設(shè)了一個研究區(qū)域(加拿大的馬林郡)，仍需后續(xù)研究的補(bǔ)充才能在更寬泛的尺度上得以論證。

5野外和苗圃防治

目前，雖然有各種方法可以降低P．ramorum的影響，但并沒有一項(xiàng)可以確保消除此病原菌，甚至難以確保1株樹免受其害。由于林分類型不一，同一種方法不可能適用于所有的森林類型，民眾接受程度以及財政負(fù)擔(dān)程度也是一些舉措能否成功應(yīng)用的決定性因素。但是，如果認(rèn)真、徹底地采取某些措施，是可以減緩病原菌的傳播速度，降低病原菌對樹木危害的。

5．1野外防治

在美國的俄勒岡州，人們基于景觀和地區(qū)水平開展對P．ramorum的防治管理工作，以徹底根除所在林地發(fā)現(xiàn)的病原菌。措施包括:飛機(jī)偵測和水道監(jiān)控等一系列的前期檢測;由美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢疫局和俄勒岡州農(nóng)業(yè)部共同領(lǐng)導(dǎo)檢疫，以阻止本地區(qū)的染病寄主材料移出;一旦發(fā)現(xiàn)有樹木感染，不管有沒有產(chǎn)生癥狀，立即移除，并在每一個受侵染的樹木周圍設(shè)立91.44m的緩沖區(qū)。

5．1．1栽培技術(shù)

SwieckiT等做了一項(xiàng)研究，如果在一棵禾葉櫟周圍5m范圍內(nèi)栽種月桂樹，即可有效預(yù)測疾病風(fēng)險，降低橡樹受侵害的可能。這為采用改變栽培技術(shù)的方法幫助林木抵抗P．ramorum提供了強(qiáng)有力證據(jù)［37］。

5．1．2化學(xué)防治

GarbelottoM等對健康的櫟樹和密花石櫟使用亞磷酸鹽殺真菌劑處理，效果良好［38］。亞磷酸鹽并非直接作用于疫霉屬病原菌，而是通過注射至樹干或直接噴灑在樹干表面促使樹木產(chǎn)生各種各樣的免疫反應(yīng)，對生態(tài)環(huán)境無任何污染。

5．1．3造林方式

ValachovicY等在美國加州西北海岸的洪堡郡做了一個試驗(yàn)，通過改變造林方式來防治P．ramorum［39］。在受侵染的林分設(shè)置許多重復(fù)試驗(yàn)，通過鋸割并轉(zhuǎn)移密花石櫟和月桂樹來降低潛在的菌株密度。這是美國加州第一次基于林分水平的大規(guī)模造林試驗(yàn)的嘗試。

5．2苗圃防治

5．2．1化學(xué)防治

針對重要的觀賞植物和圣誕樹進(jìn)行了多種化學(xué)藥劑防治試驗(yàn)—P．ramorum的主要4屬寄主植物，即杜鵑屬、山茶屬、莢蒾屬和馬醉木屬。精甲霜靈、甲霜靈、烯酰嗎啉、咪唑菌酮4種最有效。多種研究表明:化學(xué)藥劑一般只能起到預(yù)防作用，并不能根除病原菌，需要重復(fù)間隔使用，而且掩飾病害癥狀、影響檢疫，長期使用病原菌會產(chǎn)生抵抗力［40］。

5．2．2灌溉用水

如果灌溉用水的源頭是溪流，則有可能被森林里的病原菌侵染，很多研究的焦點(diǎn)集中在根除灌溉用水中含有的P．ramorum菌株。WerresS等設(shè)立了一個水再循環(huán)模擬系統(tǒng)，用2a的時間研究P．ramorum在不同季節(jié)水中的存活率與感染率［41］。容器育苗的苗圃把容器里的再循環(huán)水作為灌溉用水，研究病原菌在水中的傳染病學(xué)是非常重要的，這項(xiàng)研究可以了解P．ramorum在水中可能的傳播方式。UferT等在德國做了3種類型的過濾實(shí)驗(yàn):慢砂濾池法、熔巖過濾法、人工濕地法，結(jié)果表明，前兩種方法可以完全濾除P．ramorum菌株，人工濕地法仍有37%的水樣含有病原菌［42］。

5．2．3土壤滅菌

盡管P．ramorum在土壤中的存活時間還沒有確定，但是掌握病原菌在苗圃土壤里的分布并對侵染區(qū)隔離治理卻十分必要。大量的化學(xué)藥劑(三氯硝基甲烷、甲胺磷、碘甲烷和棉隆)篩選試驗(yàn)表明，當(dāng)受侵染的土壤放入玻璃容器時，所有藥品都是有效的。棉隆煙熏法14d可以根除自然環(huán)境下苗圃土壤剖面的病原菌［43］。蒸汽消毒和日曬等其它的土壤滅菌法也在研究中。對苗圃內(nèi)防治P．ramorum的研究已經(jīng)從個體植株擴(kuò)展到苗圃環(huán)境、病原菌隨植株跨州乃至跨國傳播等領(lǐng)域。鑒于該病菌的危害和傳播途徑，對于地區(qū)與國家之間的觀賞植物貿(mào)易往來，一定要建立一個穩(wěn)定健全的檢驗(yàn)檢疫機(jī)制。

6問題與討論

直到現(xiàn)在，對P．ramorum起源的地理中心仍然不清楚。有學(xué)者認(rèn)為起源于美國本土［44－45］，但更多的學(xué)者傾向于源自中國云南、喜馬拉雅山脈的東部或者臺灣［46］。另外，因?yàn)槊總€國家或地區(qū)的自然條件不同，各國尚未建立一套對P．ramorum成熟、穩(wěn)定的檢測方法。美國和歐盟已經(jīng)制定出P．ramorum的檢疫標(biāo)準(zhǔn)，但隨著對病原菌研究的深入，這些標(biāo)準(zhǔn)一直在調(diào)整之中，而且在許多方面有差異。

P．ramorum的寄主十分廣泛，對針、闊葉樹，喬、灌木，成熟林或苗木，都可侵染危害。迄今為止，在自然界被P．ramorum侵染并通過柯赫氏法則(Koch’sPostulates)證明的寄主植物有45種，有82種相關(guān)寄主植物是在自然界發(fā)病、經(jīng)分離培養(yǎng)或PCR分子技術(shù)檢測到P．ramorum，但未通過柯赫氏法則證明，還有許多植物已通過人工接種試驗(yàn)發(fā)?。?7］。中國幅員遼闊，樹種繁多，多數(shù)寄主植物都有分布。鑒于P．ramorum傳入、定殖以及擴(kuò)散的風(fēng)險性相當(dāng)大，每個國家和地區(qū)都要做好相應(yīng)的檢疫及防范措施，加大科研投入，以有效控制該病原菌對全世界造成的危害。