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本文作者：?jiǎn)态?、蔡鑫澤、趙連爽、陳冬、劉穎單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室、沈陽(yáng)軍區(qū)第二零二醫(yī)院綜合內(nèi)科

也稱貝氏柯克斯體,是細(xì)胞內(nèi)生短小桿菌(圖1),其在酸性條件下代謝旺盛、在細(xì)胞漿的Endsome內(nèi)繁殖,形成內(nèi)封入體。C.b是Q熱的病原菌,Q熱是分布最廣的人獸共患傳染病之一[12]。由于Q熱在臨床上無(wú)特異癥狀和體征,因而與其他熱性傳染病難以鑒別,誤診率極高,應(yīng)引起足夠重視Q熱分為急性Q熱和慢性Q熱。急性Q熱多有報(bào)道,慢性Q熱死亡率高難以治愈。鑒于Q熱患者的臨床表現(xiàn)多種多樣,一般以發(fā)熱、咳嗽、頭痛、肌肉酸痛為主要癥狀,并常伴有肺炎、肝炎、心內(nèi)膜炎、大動(dòng)脈瘤等,與其他立克次體病的不同之處是無(wú)皮疹及外斐氏反應(yīng)陰性。在缺乏實(shí)驗(yàn)室檢查和流行病學(xué)資料分析往往未被重視的情況下,Q熱的誤診和漏診相當(dāng)嚴(yán)重。世界范圍內(nèi)Q熱的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),感染途徑不明的病例增多,有報(bào)道稱與寵物增多呈正相關(guān),我們從食品安全的角度,驗(yàn)證雞蛋是否是潛在的Q熱傳染源之一[35]。

1材料與方法

1.1Coxiellaburnetii(C.b)菌PCR標(biāo)準(zhǔn)品及陽(yáng)性對(duì)照CoxiellaburnetiigenomeDNA來(lái)源于NineMillII相菌,用引物OPM1:(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM4:(5′-TTGGAAGTTATCACGCAGTTG-3′),進(jìn)行PCR反應(yīng):95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)得到27kD外膜蛋白Com1基因的501bp的DN段。用膠DNA回收試劑盒(TaKaRa)回收501bpDN段后,測(cè)定DNA濃度,系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品用于定量PCR反應(yīng)。

1.2主要儀器PCR及巢式PCR反應(yīng)使用ABIGeneAmpPCRsystem9700;定量PCR使用Corbett,測(cè)序儀使用ABI3130GeneticAnalyzer,熒光顯微鏡使用NIKON。

1.3試劑(1)PBST(g/L):NaCl8,Na2HPO42.89,KCl0.2,KH2PO40.2,Tween-201mL。(2)洗凈液:10mmol/LTris緩沖液(pH7.2)含有0.5%NP-40,0.25%Tween-20。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1雞卵總DNA提取方法:先取約1/9雞卵黃,用40mLPBST稀釋后、用2000r/min離心30min去沉淀,取上清再用10000r/min高速離心30min后取沉淀,沉淀用洗凈液2mL洗凈離心2次,將沉淀放入80°C冰箱冷凍20min,解凍反復(fù)操作3次后,用含有50mg/L蛋白消化酶K的裂解液(Promega,E397A)200μL,56°C2h消化處理后[6],用磁珠法提取DNA(TOYOBO,NPK-501)。

1.4.2定量PCR測(cè)定:引物OPM1(5′-AGTAGAAGCATCCCAAGCATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),應(yīng)得到27kD外膜蛋白Com1基因的472bp的DN段。將上述雞卵總DNA提取物的1/30(2μL),按照TaKaRaSYBRPremixExTaqTMII試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,PCR反應(yīng)條件為:95°C30s;95°C5s,55°C30s,72°C30s,共40個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖電泳后,確認(rèn)產(chǎn)物為472bp的片段[7]。

1.4.3巢式PCR:引物OPM2(5′-TGCCTGCTAGCTGTAACGATTG-3′)和OPM3(5′-GAAGCGCAACAAGAAGAACAC-3′),應(yīng)得到27kD外膜蛋白Com1基因的438bp的DN段。100μL體系含有:10×反應(yīng)緩沖液10μL、2.5mmol/LdNTPs8μL、25mmol/LMgCl212μL、每種引物為80mmol/L0.8μL、Taq酶0.4μL,定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物2μL,用純凈水加到100μL。反應(yīng)條件為:95°C5min;95°C30s,58°C30s,72°C90s,共30個(gè)循環(huán)。2%瓊脂糖電泳后,確認(rèn)產(chǎn)物438bp片段[8]。1.4.4PCR產(chǎn)物測(cè)序:用2%瓊脂糖電泳后,切膠回收DN段,精制試劑盒精制PCRDN段產(chǎn)物,以O(shè)PM2為引物用直接測(cè)序法測(cè)定精制PCRDN段產(chǎn)物[9]。1.4.5雞血球免疫熒光染色:用肝素抗凝抽取雞血涂片并固定,用抗C.bCom1表面蛋白單克隆抗體稀釋2000倍作為一抗染色37°C、2h洗凈后,再用兔抗鼠熒光標(biāo)識(shí)抗體稀釋5000倍做為二抗染色后洗凈,用光學(xué)及熒光顯微鏡照相。

2結(jié)果

2.1定量PCR加巢式PCR法測(cè)定C.b菌基因的感度用OPM1和OPM3作為C.b定量PCR反應(yīng)引物,用C.b菌PCR標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,標(biāo)準(zhǔn)曲線R2達(dá)到0.999。用OPM1和OPM3作為引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物為472bp長(zhǎng)度的DN段,可測(cè)出大約40個(gè)C.b基因片段;在定量PCR的基礎(chǔ)上,用OPM2和OPM3進(jìn)行巢式PCR反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物為438bp長(zhǎng)度的DN段,可以在定量PCR的感度基礎(chǔ)上增加10倍,可測(cè)出大約4個(gè)C.b基因。

2.2實(shí)際雞卵的C.b菌DNA含量圖2為實(shí)際從雞卵中提取總DNA,進(jìn)行定量PCR反應(yīng)的部分電泳圖?？梢?jiàn)29、66、125、169、150、164號(hào)雞卵為陽(yáng)性,特異片段長(zhǎng)度為472bp。定量PCR測(cè)定雞卵可能保有的C.b菌量(表1),推算一個(gè)雞卵黃中可能含有的C.b分子數(shù),從104到106不等。它們中有2個(gè)PCR片段測(cè)序失敗,其余6個(gè)片段測(cè)序皆為C.bCom1基因的一部分,其中150號(hào)基因有變異(表2)。

2.3雞卵C.b菌DN段的測(cè)序及突變位點(diǎn)的確定用上游及下游引物同時(shí)測(cè)序定量PCR472bp片段,雞卵黃DNACom1基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果中,與Ninemile菌株同部位基因相比的突變位點(diǎn)。表2中表示的突變位點(diǎn)是分別用上游引物與下游引物直接測(cè)序后,同時(shí)發(fā)生變異的位點(diǎn),同時(shí)該位點(diǎn)沒(méi)有其他可疑堿基峰出現(xiàn)。帶下劃線的堿基字母表示與Ninemile菌株同位點(diǎn)有變異;帶下劃線的氨基酸表示突變氨基酸。與Ninemile菌的Com1基因相比,有12個(gè)雞卵C.bCom1基因有突變出現(xiàn),其中8個(gè)引起氨基酸突變,4個(gè)突變?yōu)榘被犰o止性突變。有4個(gè)雞卵呈現(xiàn)2個(gè)以上的突變位點(diǎn),1個(gè)雞卵中最多可測(cè)到4個(gè)突變位點(diǎn),有2個(gè)氨基酸突變(表2)。

2.4雞血涂片間接特異性抗體免疫熒光染色光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)雞紅血球?yàn)橛泻司鶆驒E圓形,白血球?yàn)椴灰?guī)整形有核;熒光顯微鏡下可見(jiàn)同一圖像的白血球內(nèi)有多數(shù)密集的熒光顆粒存在,確認(rèn)為C.b內(nèi)封入體(圖3)。

3討論

我們用定量PCR加上巢式PCR法可以使PCR反應(yīng)感度增加10倍左右,用一般PCR反應(yīng)產(chǎn)生501bp片段產(chǎn)物,通過(guò)膠回收法回收該片段,定量DNA濃度,以10倍系列稀釋該DNA產(chǎn)物并作為模板,用上述定量PCR加巢式PCR法反應(yīng),定量PCR反應(yīng)階段可測(cè)出40個(gè)Com1基因[10],加上巢式PCR反應(yīng)最多可測(cè)出4個(gè)Com1基因片段。理論上,如果C.b的整個(gè)基因只含有一個(gè)PCR特異性反應(yīng)位點(diǎn),并且整個(gè)基因做為底物與PCR產(chǎn)物做為底物的PCR反應(yīng)差異可以忽略,那么用定量PCR加巢式PCR反應(yīng)可以測(cè)出4個(gè)C.b菌的存在。實(shí)際上我們用上述定量PCR法,應(yīng)用于雞卵中,僅測(cè)出104左右的C.b菌。感度降低了數(shù)百倍,可能是由于雞卵中提取的DNA雜質(zhì)較多,并且卵黃中的高蛋白高卵磷脂可能是影響PCR反應(yīng)的主要原因。用定量PCR反應(yīng)測(cè)定雞卵中的C.b菌Com1基因數(shù)量,在標(biāo)準(zhǔn)品的選用上,我們沒(méi)能直接用C.b基因做為標(biāo)準(zhǔn)品,是由于C.b是細(xì)胞內(nèi)菌,沒(méi)有準(zhǔn)確的定量方法,同時(shí)整體基因達(dá)2000kb左右,計(jì)數(shù)誤差大,不準(zhǔn)確。用501bpPCR反應(yīng)產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品,反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線R2高達(dá)99.99,曲線完美。我們用此方法推測(cè)一個(gè)雞卵中的C.b菌基因數(shù)可達(dá)到106左右。我國(guó)也對(duì)C.b的檢測(cè)做了大量的工作,亞紅祥等[11]通過(guò)TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)ISlllla基因檢測(cè)可以檢出10個(gè)基因數(shù)左右,并且他們用ISlllla基因片段(485bp)克隆質(zhì)粒DNA模板作為標(biāo)準(zhǔn)品,相對(duì)于我們用PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)說(shuō),更具有說(shuō)服力,為今后標(biāo)準(zhǔn)品的改進(jìn)提供了方法學(xué)依據(jù)。我們分別測(cè)定了Com1基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的序列,發(fā)現(xiàn)有突變菌株。從Com1的97號(hào)到177號(hào)共80個(gè)氨基酸序列中,有8個(gè)雞卵的C.bCom1基因發(fā)生變異,14個(gè)發(fā)生基因變異。我們選定變異菌株的條件是,一定用Forward及Reverse雙側(cè)引物分別測(cè)序并予以重復(fù)實(shí)驗(yàn),在同一位點(diǎn)發(fā)生同一樣變異的序列定為變異菌株,變異菌株也反證了雞卵中C.b菌存在的真實(shí)性;我們也對(duì)C.b陽(yáng)性雞卵進(jìn)行濃縮后,對(duì)免疫缺陷(SCID)鼠進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn),鼠臟器免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明為陽(yáng)性(結(jié)果待發(fā)表),因此,我們確信本研究結(jié)果的真實(shí)性。為了佐證雞可以感染C.b,我們捉取雞身上的寄生蟲(chóng)、雞螨蟲(chóng)等30個(gè)抽提DNA并進(jìn)行PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn),C.bPCR陽(yáng)性的占50%左右(結(jié)果未顯示)。我們對(duì)雞血涂片進(jìn)行了大量的熒光染色測(cè)定,發(fā)現(xiàn)雞白細(xì)胞中可以感染C.b菌,并能增殖。C.b菌在單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞內(nèi)繁殖,雞白細(xì)胞內(nèi)確認(rèn)到C.b菌證明C.b菌可以感染雞,由于其寄生生物提取DNAC.bCom1基因PCR反應(yīng)陽(yáng)性,因此通過(guò)螨蟲(chóng)感染傳播的可能性極大。以前有報(bào)道在雞卵黃中可以分離到幽門(mén)螺菌,并證明有致病性,因此,我們推測(cè)雞卵中的C.b菌也應(yīng)該具有感染性。而最終能否從雞卵中分離并培養(yǎng)出有生物活性的C.b菌是確定雞卵是否是C.b菌感染源之一的唯一必要條件,鑒于C.b菌是細(xì)胞內(nèi)菌,培養(yǎng)困難,還需要進(jìn)一步的研究[1214]。