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本文作者：張越己1秦盛1卞光凱1費世明2李欽1曹成亮1王樂輝2蔣繼宏1

作者單位：1.江蘇師范大學(xué)2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)是耐旱而非食用型的油種子植物,很容易適應(yīng)半干旱土壤和荒地,因此麻瘋樹被認為是潛在的可替代能源植物。在印度,麻瘋樹已晉升為該國的生物柴油資源[1]。此外,麻瘋樹也是重要的藥用植物,其代謝產(chǎn)物具有抗病毒、抗腫瘤等藥用價值。然而麻瘋樹抗寒能力較弱,因而在高海拔寒冷地區(qū)以及我國中東部的栽培與引種受到了限制。另外,近年來我國南方常遭遇連續(xù)降雪、冰凍、干旱等惡劣天氣,使得麻瘋樹生長也面臨著如何有效提高幼苗的抗寒性、抗干旱能力的嚴峻問題。因此,如何提高該物種在低溫、干旱環(huán)境的適應(yīng)性及其初期幼苗活力,建立良好的生長體系,已成為綜合開發(fā)該資源必須解決的問題和實現(xiàn)麻瘋樹各種生物價值的重要途徑。植物根際促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,pgpr)是指生存于植物根際、根表,并能間接或直接地促進或調(diào)節(jié)植物生長的微生物[2]。PGPR能夠通過協(xié)助植物從環(huán)境中攝取養(yǎng)分來進行直接的促生作用;也能夠降低惡劣環(huán)境給植物造成的傷害而間接地產(chǎn)生促生作用。盡管PGPR的促生機制還沒有完全弄清楚,但是它多樣的促生作用已被廣泛接受。其促生機制主要包括:(1)產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的信號物質(zhì),如赤霉素、吲哚乙酸、細胞分裂素和乙烯;(2)非共生固氮;(3)產(chǎn)嗜鐵素、抗生素和氰化物抵抗病原菌;(4)溶解磷礦物及其它養(yǎng)分[3]。一些PGPR也能通過影響共生固氮結(jié)瘤、結(jié)節(jié)促進植物生長[4]。另外已有的研究表明[5],存在于植物根際土壤并能產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脫氨酶的天然細菌可以把乙烯合成的前體ACC水解成氨和α-丁酮酸,并將這兩種分解產(chǎn)物分別作為N源和C加以利用,從而降低應(yīng)激乙烯的含量,減輕逆境脅迫對植物造成的傷害,促進植物生長。因此,以ACC脫氨酶為主要指標(biāo)來篩選根際促生菌用以提高植物對外界環(huán)境的適應(yīng)性是個很好的切入點,具有較好的應(yīng)用前景。目前,對麻瘋樹的研究多集中于對其資源分布、化學(xué)成分、生物柴油轉(zhuǎn)化技術(shù)、生理脅迫、良種選育和繁殖技術(shù)等方面,而麻瘋樹根際具有ACC脫氨酶活性促生菌的研究國內(nèi)外還未見報道。本文通過對麻瘋樹根際細菌的分離以及對菌株進行促生指標(biāo)的篩選,尋找有潛在促生作用的菌株,為后續(xù)微生物提高麻瘋樹抗寒、抗干旱能力的研究提供菌種資源,并為植物-根際促生菌的進一步深入研究打下前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源:樣品采自四川省攀枝花市延邊縣麻瘋樹種植基地,野生麻瘋樹根部及其根際土壤一并帶回處理。

1.1.2培養(yǎng)基:細菌分離培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(NA)、LB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、蔗糖無機鹽培養(yǎng)基(YN)、R2A培養(yǎng)基、KMB培養(yǎng)基、1/4ISP2培養(yǎng)基及改良后的BPA培養(yǎng)基(加入200mL根際土壤浸提液)。促生篩選培養(yǎng)基:有氮培養(yǎng)基、無氮培養(yǎng)基、SM培養(yǎng)液、無機磷培養(yǎng)基參照文獻[6]配制。以上培養(yǎng)基配好后置于1×105Pa滅菌20min。SMA培養(yǎng)基:向SM培養(yǎng)基中添加經(jīng)濾器過濾除菌的1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC),使其終濃度為3mmol/L。

1.1.3主要試劑及儀器:ACC購自Sigma公司,Taq酶及pMD-18T連接試劑盒購自TaKaRa公司,16SrRNA基因擴增引物由上海生工生物工程公司公司合成;SpectromaxM2多功能全自動定量繪圖酶標(biāo)儀(美國MolecularDevices),PTC200梯度PCR儀(美國MJR．I),凝膠成像儀,冷凍離心機。

1.2根際土壤中細菌的分離

稱取1g土樣于滅菌的50mL錐形瓶中,加入4mL滅菌水,超聲(150W)15min使泥土分散,之后振蕩將其混勻。取溶液于1.5mL離心管中再分別稀釋102、103、104、105和106。從其中各吸取100μL于LB平板上涂布均勻。置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35d。待平板上出現(xiàn)較多單菌落時,在無菌條件下挑取菌落顏色、形態(tài)等培養(yǎng)性狀不同的單菌落分別接種于LB斜面上保存。

1.3根際細菌促生活性的篩選

1.3.1產(chǎn)ACC脫氨酶能力的測定:(1)定性測定:菌株接種于SMA固體培養(yǎng)基,選取傳代5次后能夠在唯一氮源為ACC的培養(yǎng)基上生長的菌株為產(chǎn)ACC脫氨酶陽性菌株。(2)定量測定:菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,將所獲得的培養(yǎng)物在4°C下以8000r/min離心10min,之后收集菌體,用SM培養(yǎng)液洗滌離心2次,菌體懸浮于SMA培養(yǎng)液,在28°C旋轉(zhuǎn)搖床180r/min的條件下培養(yǎng)24h,以誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶。4°C離心收集菌體,用0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.6)洗滌離心2次,重新懸浮于600μL0.1mol/LTris-HCl緩沖液中(pH8.5),然后加入30μL甲苯并迅速振蕩30s以破碎細胞。ACC脫氨酶活性的測定方法參照Honma[7]和Saleh[8]的方法,于540nm下測定其OD值。ACC脫氨酶的單位酶活為在測酶體系中以1μmol/min的速率形成α-丁酮酸的活性。蛋白質(zhì)測定采用Bradford比色法[9],以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算得到線性方程。ACC脫氨酶酶活單位為μmolα-KA/(mg•h),各菌株酶活性測定均扣除樣品對照中自發(fā)產(chǎn)物后計算。

1.3.2產(chǎn)生長素(IAA)能力的測定:(1)定性測定:向含有氮元素培養(yǎng)液中添加除菌后的色氨酸溶液,使色氨酸濃度最終達到0.5g/L。挑取菌株接種于上述培養(yǎng)液中,37°C搖床培養(yǎng)24h,用無菌槍頭吸取1mL菌液于無菌離心管中,加入2mLSackowcki’s顯色劑[10]之后迅速充分混合,室溫下避光顯色20min。出現(xiàn)粉紅色為陽性,說明有IAA產(chǎn)生。(2)定量測定:陽性菌株避光放置30min,測定其OD530值。通過IAA濃度與OD530的線性方程計算相應(yīng)的IAA濃度,每組實驗重復(fù)3次。各菌株IAA含量測定均扣除樣品對照中自發(fā)產(chǎn)物后計算。

1.3.3固氮能力測定:將菌株接種于無氮培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)38d觀察其生長情況,轉(zhuǎn)接5次。

1.3.4解磷能力測定:將菌株接種于無機磷培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)38d,觀察有無溶磷圈。1.3.5產(chǎn)鐵載體能力測定:將菌株接種于CAS檢測培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)23d,觀察培養(yǎng)基上有無形成橙色鐵載體分泌圈[11]。

1.4根際細菌16SrRNA基因序列的測定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌株總DNA的提取參照文獻[12]的方法進行;PCR擴增采用細菌16SrRNA通用引物[13],27f:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′;1492r:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。PCR反應(yīng)條件為:94°C5min;95°C1min,55°C1min,72°C90s,共35個循環(huán);72°C10min。PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。依照測序結(jié)果,從NCBI(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和EzTaxon()數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株16SrRNA基因序列,分別用ClustalX2.0及MEGA5.0[14]軟件進行序列比對分析,最后用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,并做系統(tǒng)發(fā)育分析。

2結(jié)果與分析

2.1土壤根際細菌的分離

在NA、LB、TSA、YN、R2A、改良后的BPA、KMB及1/4ISP2這8種培養(yǎng)基上涂布混合的土壤懸液,共分離得到98株細菌,根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小等特征初步去重復(fù)后獲得28株細菌,繼而對這28株細菌進行促生潛在性評價。

2.2內(nèi)生細菌的促生長潛力

從表1中可以看出,28株供試菌株中有15株具有固氮的能力,占總菌株的54%;9株具有解磷的能力,占總菌株的32%;僅有2個菌株能產(chǎn)生鐵載體,占總菌株的7%;有19株菌可以產(chǎn)生IAA(68%),其中KLBMP4820、KLBMP4806、KLBMP4807及KLBMP4804產(chǎn)IAA的含量分別高達57.063±0.016、50.811±0.001、54.467±0.017及50.439±0.015mg/L。在之前的ACC脫氨酶活性定性篩選中,經(jīng)5次傳代后有13株(46%)細菌仍能夠在SMA固體培養(yǎng)基上正常生長,這說明他們具有ACC脫氨酶活性。據(jù)文獻報道,當(dāng)ACC脫氨酶酶活不低于20nmolα-KA/(mg•h)時,就可促進植物的生長[15]。通過進一步的定量檢測顯示,13株菌的ACC脫氨酶酶活均高于20nmolα-KA/(mg•h)。而菌株KLBMP4801、KLBMP4828、KLBMP4803、KLBMP4802以及KLBMP4806和KLBMP4804的ACC脫氨酶酶活較高,最高達到128.308±0.577μmolα-KA/(mg•h)。另外KLBMP4801、KLBMP4802、KLBMP4804、KLBMP4806、KLBMP4821,KLBMP4826和KLBMP4828這幾株菌同時具有產(chǎn)ACC脫氨酶及IAA的能力,且與之前一些研究相比,IAA含量和ACC脫氨酶含量都有所上升。值得關(guān)注的是,本研究獲得的KLBMP4821菌株屬于窄食單胞菌屬,而有研究表明,該屬的大部分細菌能夠在宿主植物中定殖并對植物具有促生等有益作用[16]。KLBMP4803、KLBMP4808和KLBMP4810這幾株菌也有較高的ACC脫氨酶酶活,但并無產(chǎn)IAA的能力。而KLBMP4807、KLBMP4820和KLBMP4827等幾株菌產(chǎn)IAA的含量較高,卻不具備產(chǎn)ACC脫氨酶的能力。綜合幾個促生指標(biāo)的檢測結(jié)果:獲得了幾株同時具備多個促生指標(biāo)的菌株以及一些僅具單一促生指標(biāo)能力但含量較高的菌株。由此推斷,四川省麻瘋樹根際土壤中應(yīng)該擁有較多具有潛在促生長作用的細菌,而這些菌株也有一定的研究價值。

2.3根際細菌16SrRNA基因序列的測定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

從麻瘋樹根際土壤中分離后經(jīng)促生指標(biāo)初步篩選出的22株細菌(其中6株屬于經(jīng)典產(chǎn)絲放線菌,待進一步單獨研究,因此不在本文中列出),以提取的總DNA為模板,擴增得到16SrRNA基因序列。結(jié)果顯示,它們屬于Firmicutes門,Proteobacteria門和Actinobacteria門的三大系統(tǒng)發(fā)育類群(表2)。經(jīng)統(tǒng)計共8個屬,其中有11株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),為分離菌株總數(shù)的50%,占主要地位。而其中的KLBMP4802、KLBMP4804以及KLBMP4820均為產(chǎn)ACC脫氨酶或IAA較高的菌株。KLBMP4806和KLBMP4816屬于糞產(chǎn)堿桿菌屬(Advenella);KLBMP4814和KLBMP4810兩株菌屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter);KLBMP4821屬于窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas);KLBMP4826和KLBMP4829屬于假單胞菌屬(Pseudomonas);KLBMP4803屬于西地西菌屬(Cedecea);KLBMP4827屬于產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)。而KLBMP4817和KLBMP4824屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus),這也充分顯示了四川麻瘋樹根際細菌的豐富多樣性。經(jīng)MEGA5構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹分析(圖1)以及在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行有效種的16SrRNA基因序列相似性搜索后發(fā)現(xiàn),其中KLBMP4817(1462bp)與該屬的典型菌株相似性低于98%,與最近的標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)aenibacillusfonticolaZLT相似性為97.8%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖2)又獨立成一進化分支并且有較高的自舉值,可能為潛在的新種。而與KLBMP4821(1454bp)的16SrRNA基因相似性高于97%的菌有6株,但從系統(tǒng)進化樹上來看(圖3),KLBMP4821只與Stenotrophomonaschelatiphaga(EU573216)、Stenotrophomonaspavanii(FJ748683)以及Stenotrophomonasmaltophilia(AB008509)同聚在一個大分支上,并有較高的自舉值。同樣,KLBMP4824(1455bp)與Paenibacillusgly-canilyticus(AB042938)以及Paenibacillusxinji-angensis(AY839868)聚在系統(tǒng)發(fā)育樹的一個分支上(圖4),而KLBMP4824與這兩株菌的相似性分別為98.7%和97.0%。另外,經(jīng)由對菌株KLBMP4817、KLBMP4821和KLBMP4824的表型及生理生化特征與各自相關(guān)的典型菌株之間的比較分析,均存在較大差異性,因此我們初步認為它們代表Stenotrophomonas和Paenibacillus屬的新種,但要最終確定它們的分類地位,仍需綜合各自形態(tài)特征、生理生化與化學(xué)分類特征以及與最近菌株的DNA-DNA同源性分析結(jié)果來判斷,而我們也正同時進行這些新種鑒定工作的研究,相關(guān)文章將在后期發(fā)表。

3討論

目前國內(nèi)對麻瘋樹已經(jīng)進行了大量的研究,通過對種植資源分布的調(diào)查,基本摸清了麻瘋樹的種植和分布地帶,在此基礎(chǔ)之上,建立了生物物質(zhì)能源植物數(shù)據(jù)庫。但是,麻瘋樹目前只自然分布于我國的熱帶和亞熱帶地區(qū),分布范圍比較有限;雖然麻瘋樹幼苗對鹽脅迫、干旱脅迫以及低溫脅迫具有一定的抗逆性,但要想在我國其它地區(qū)大面積推廣栽培,就必須進一步加以研究以提高其抗逆性[17]。

研究發(fā)現(xiàn),植物根際促生菌(PGPR)通?？梢酝ㄟ^直接和間接兩種方式來促進植物的生長和發(fā)育[18]。此外,PGPR還能夠提高植物耐非生物脅迫的能力(如鹽脅迫和干旱脅迫等)[19]。同時研究表明,ACC脫氨酶被認為能降低植物乙烯的濃度,是PGPR促進植物生長發(fā)育的主要機制之一。迄今為止,國內(nèi)外已有許多科研人員報道了具ACC脫氨酶活性的植物根際促生菌能提高植物的抗極端溫度脅迫和土壤pH脅迫[20],抗水澇脅迫,抗重金屬脅迫,能夠增加植物在鹽堿環(huán)境中的成活率,延長水果保質(zhì)期,有效防止病原菌對植物的傷害等[21]。本文首次對麻瘋樹根際具有ACC脫氨酶活性的菌株進行了分離篩選,發(fā)現(xiàn)在28株供試菌株中,46%的菌株能產(chǎn)生ACC脫氨酶,有54%的菌株具有固氮能力;32%的菌株具有解磷能力;68%的菌株能產(chǎn)生IAA;其中有13株菌株的ACC脫氨酶酶活超過了20nmolα-KA/(mg•h),最高含量達到128μmolα-KA/(mg•h)。比滕松山[22]報道中的ACC脫氨酶活性以及吉秀云[23]報道的IAA及ACC脫氨酶活性均有較大幅度的提升。

目前,已報道的具有促進植物生長的細菌主要包括:芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、微桿菌屬(Microbacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、弧菌屬(Vibrio)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter)[5,15,2427]等。在本文的研究中,綜合ACC脫氨酶、IAA、固氮、解磷、產(chǎn)鐵載體等5個指標(biāo)及經(jīng)16SrRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌屬的菌株KLBMP4802、KLBMP4809、KLBMP4804,窄食單胞菌屬的KLBMP4821等都具有較強的潛在促生作用,這與之前的有關(guān)研究相符;然而本研究得到的糞產(chǎn)堿桿菌屬的菌株KLBMP4806和KLBMP4816,節(jié)桿菌屬的KLBMP4810、KLBMP4814等也具有較強的促生長潛在性,這也擴大了已知的具有潛在促生長作用的細菌種屬范圍。本實驗室也同時運用富集定向篩選法篩選出具有ACC脫氨酶活性的菌株,但這些菌株的實際促生作用究竟如何,仍需通過進一步的盆栽試驗來驗證。

綜上所述,四川省攀枝花市麻瘋樹基地土壤中不僅含有大量的細菌資源,而且具有豐富的多樣性,其中不乏高促生作用的細菌類群,這不僅為我們?nèi)蘸笱芯繉β榀倶溆写偕饔玫木甑幕亟犹峁┝撕芎玫牟牧?也為研究微生物對麻瘋樹的抗寒、抗旱、促生、抗病蟲、快繁等方面提供了良好的資源。