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本文作者：王亞飛1張金艷2作者單位：1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)文理學(xué)院2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)教務(wù)處

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽(yù)[1]，它是世界上栽培最早、分布面積最廣的一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草。苜蓿中富含蛋白質(zhì)、維生素、無機(jī)鹽及促生長(zhǎng)因子，其鮮草中粗蛋白質(zhì)含量為4.5%~5.9%，干草中蛋白質(zhì)含量約為15%~25%，比玉米高1~1.5倍[2]。近年，由于食用農(nóng)藥殘留超標(biāo)的蔬菜而引起食物中毒的事件時(shí)有發(fā)生，為了阻止有毒蔬菜進(jìn)入市場(chǎng)，在蔬菜上市前進(jìn)行農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)是比較可行的辦法。目前，快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留用植物酯酶都是以糧食作物如小麥[3]、大豆[4]、蕎麥、豌豆、玉米[5]等為酶源，檢測(cè)成本雖然比動(dòng)物酶源低，但畢竟需要消耗糧食。本文試驗(yàn)從價(jià)格更加低廉的苜蓿中提取植物酯酶，進(jìn)行分離、純化，并系統(tǒng)地對(duì)該酯酶的動(dòng)力學(xué)特性及農(nóng)藥檢測(cè)效果進(jìn)行研究，為尋求植物酯酶新酶源提供依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

UV-2802PCS型紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：法國(guó)JOUAN；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-(S)6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.2試劑

硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉等：國(guó)產(chǎn)分析純；2,6-二氯靛酚：德國(guó)。

2實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

粗酶的提取：稱取100g苜蓿嫩葉，用研缽研成勻漿，按料液比(w/v)1:10加入pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，移入錐形瓶中震蕩10min，4層紗布過濾，濾液用4000~6000r/min的速度低溫離心15min，取上清液，將粗酶液保存在4℃冰箱中備用。分級(jí)純化：在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.3飽和度)，在1h內(nèi)加完后置于4℃冰箱中過夜。次日將上清液用虹吸管吸出，下面渾濁液用4000r/min的速度低溫離心15min，棄沉淀合并上清液。在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.6飽和度)，在1h內(nèi)加完后置于4℃冰箱中過夜。次日，將上清液用虹吸管吸出，沉淀用5000r/min的速度低溫離心15min，棄上清液，保留沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，裝于透析袋(分子量大于10000u)中，4℃下置于pH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中透析24h，中間換4次緩沖溶液，直至無SO42-析出為止(用氯化鋇檢驗(yàn))。將沉淀溶于1LpH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中。

2.2試驗(yàn)方法

不同農(nóng)藥最低檢測(cè)限(LDC)的確定：根據(jù)所用UV-2802PCS型紫外可見分光光度計(jì)的誤差范圍，以可以檢測(cè)到的最小吸光度對(duì)應(yīng)的農(nóng)藥濃度為初定檢測(cè)限，在此濃度下與空白液進(jìn)行t檢驗(yàn)(n=6)，用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，從而確定LDC。結(jié)果見表1。

3結(jié)果與分析

3.1最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定及反應(yīng)進(jìn)程曲線

取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，在40℃水浴中繼續(xù)恒溫20min，在550~640nm范圍內(nèi)改變波長(zhǎng)，測(cè)定不同波長(zhǎng)下酶促反應(yīng)產(chǎn)物的A值。從圖1可見，最大吸收峰在605nm，因此在比色分析中，測(cè)定波長(zhǎng)選擇605nm。取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，40℃水浴中繼續(xù)恒溫。在605nm波長(zhǎng)下，分別測(cè)定顯色10、20、30、40、50、60、70、80min時(shí)產(chǎn)物的A值。結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果顯示，在0~20min內(nèi)反應(yīng)速率增大得很快，20min后，反應(yīng)速率增加緩慢。本實(shí)驗(yàn)選擇1~4min吸光度值的變化進(jìn)行酶促反應(yīng)計(jì)算。

3.2鹽的種類和濃度對(duì)酯酶活力的影響

改變提取劑的種類、濃度及pH值提取苜蓿酯酶，分別測(cè)定總酯酶活力和比活力，結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4中可見，用pH值7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酶液活性和比活力均最高。

3.3溫度對(duì)酯酶活力的影響

當(dāng)其他試驗(yàn)條件不變時(shí)，分別測(cè)定顯色溫度為4、10、20、30、40、50、60、70、80℃時(shí)產(chǎn)物吸光度值。溫度對(duì)酯酶活力的影響如圖5所示。從圖5中可見，40℃時(shí)，酯酶活性最高。

3.4pH值對(duì)酯酶活力的影響

在40℃時(shí)，分別測(cè)定pH值為4.0~9.0的緩沖體系中的酯酶活力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，苜蓿酯酶在pH值6.5~7.5范圍內(nèi)活力較大，在pH7.0的緩沖體系中活力最大。

3.5料液比對(duì)酯酶活力的影響

4℃下用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，以不同料液比(1:1~1:40)提取苜蓿酯酶，并測(cè)定總酯酶活力和比活力，結(jié)果如圖7所示。從圖7中可以看出，當(dāng)料液比在1:1~1:10范圍時(shí)，隨著料液比的增加，苜蓿總酯酶活力也隨之增大，這是因?yàn)榱弦罕仍龃?，酯酶溶出充分。而?dāng)料液比達(dá)到1:10后再增大時(shí)，總酯酶活力不再增加，可能是稀釋倍數(shù)過大造成的。

3.6提取時(shí)間對(duì)酯酶活力的影響

提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，但酶活性會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。為了確定合適的提取時(shí)間，固定其他提取條件和顯色條件，改變提取時(shí)間，以確定本試驗(yàn)最佳提取時(shí)間，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出，提取前10min，酯酶活力隨提取時(shí)間的增加而增大，10min后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，在提取10min到30min時(shí)，酶活相差不大，過了30min后酯酶活性降低速度加快。這是因?yàn)檠娱L(zhǎng)提取時(shí)間，有利于酯酶的溶出，而時(shí)間過長(zhǎng)，酶活力損失過大。

3.7幾種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥的最低檢測(cè)限(LDC)

從表1中的結(jié)果可看出，苜蓿酯酶對(duì)上述5種有機(jī)磷農(nóng)藥的LDC除甲拌磷外均遠(yuǎn)小于我國(guó)和歐盟對(duì)上述農(nóng)藥最高允許殘留量(MRL)的要求，雖然甲拌磷的檢測(cè)限高于要求，但遠(yuǎn)低于目前快速檢測(cè)用小麥酯酶對(duì)甲拌磷的檢測(cè)限0.166μg/mL[6]。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從來源廣、價(jià)格相對(duì)低廉的苜蓿中提取植物酯酶，實(shí)驗(yàn)表明用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酯酶活性最高，40℃時(shí)酯酶反應(yīng)活性最大。苜蓿酯酶對(duì)久效磷、氧樂果、甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、甲拌磷的最低檢測(cè)限分別為0.024、0.050、0.009、0.003、0.002μg/mL。除甲拌磷外，對(duì)其余4種有機(jī)磷農(nóng)藥放入檢測(cè)限均低于于我國(guó)和歐盟對(duì)上述農(nóng)藥最高允許殘留量的要求。由于本實(shí)驗(yàn)只是以5種有機(jī)磷農(nóng)藥為例，所以該結(jié)論還需進(jìn)一步選取更多種類的有機(jī)磷農(nóng)藥加以驗(yàn)證。