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本文作者：孔秀梅吳蕾作者單位：天津市食品生物技術(shù)重點實驗室

由于人體不能自行合成EPA，只能從食物中攝取。魚油特別是深海魚油是EPA的主要來源，但從魚油中提取的EPA膽固醇含量高，帶有腥味，極大地影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。并且魚油中EPA的構(gòu)成和含量隨著魚的種類、季節(jié)、地理位置等不同而變化，以魚油為原料具有不穩(wěn)定的弊端[1]。因此，EPA的生產(chǎn)逐漸向利用微生物發(fā)酵合成方向發(fā)展。研究表明，利用真菌合成的EPA含量高，脂肪酸組成簡單，純化容易，并且沒有魚的腥味，合成周期短，有利于進行大規(guī)模生產(chǎn)，滿足人類日益增長的需求。另外，利用生物柴油副產(chǎn)物粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)EPA[2]，可以解決其生產(chǎn)過剩問題[3-5]，合理利用資源，降低生物柴油的生產(chǎn)成本，提高其在行業(yè)的競爭力，為生物柴油行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障[6]。

1材料與方法

1.1材料與儀器

畸雌腐霉(Pythiumirregulare)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；生物柴油副產(chǎn)物粗甘油(自制)葡萄糖、酵母膏；瓊脂；甲醇；濃硫酸；氯仿；十七烷酸(C17:0)(內(nèi)標物)等。HIRAYAMA高溫蒸汽滅菌鍋、哈雅瑪高壓滅菌鍋；振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；Scientz-50n冷凍干燥；SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；高速冷凍離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；磁力加熱攪拌器：天津市歐諾儀器儀表有限公司；GC-9A氣相色譜儀：日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1粗甘油制備

(1)稱取催化劑0.64gNaOH，將其緩慢溶解到90mL無水甲醇中，由于甲醇有毒，所以在通風櫥內(nèi)攪拌均勻，形成醇鉀或醇鈉溶液，將醇鉀或醇鈉活性溶液倒入到500mL三口燒瓶中。(2)稱取200g大豆油，倒入到500mL三口燒瓶中，控制在80℃，反應時間2h，反應過程中采用電機攪拌，并通冷凝水[7]。(3)反應完成后冷卻靜置分層，上層淺黃色半透明狀液體為粗生物柴油，下層棕色液體即為生物柴油副產(chǎn)物粗甘油。(4)將粗甘油與蒸餾水按1:4的比例混勻，以降低粗甘油的黏性；用鹽酸調(diào)pH至3，使甘油中的皂化物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x脂肪酸；靜置分層將游離脂肪酸從粗甘油溶液中分離出來。甲醇是低沸點物質(zhì)，培養(yǎng)基在121℃、15min的滅菌條件下能將甲醇從中去除，因此不需要采用額外處理方法對甲醇進行去除。

1.2.2發(fā)酵生產(chǎn)epa

1.2.2.1接種液制備

瓊脂板的制備：在水中加入20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏并充分溶解，再加入1.5%(w/w)瓊脂，調(diào)pH至6。將菌種涂布在瓊脂板上，在25℃下培養(yǎng)5d，用蒸餾水清洗瓊脂板，可用玻璃珠使孢子脫落，孢子的懸浮液即接種液[8]。

1.2.2.2培養(yǎng)基制備

(1)固體培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母膏、15g/L瓊脂糖，調(diào)pH至5.8~5.9，121℃下高溫滅菌15min。(2)液體培養(yǎng)基：30~70g/L粗甘油，10g/L酵母膏，調(diào)pH至6.0~6.5，121℃下高溫滅菌15min。

1.2.2.3菌種活化及搖瓶培養(yǎng)

(1)菌種活化：將菌種接種到滅菌后的裝有100mL固體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，25℃培養(yǎng)5d，待有菌絲長出后加入50mL無菌去離子水和若干滅菌玻璃珠，震蕩搖勻，目的是為了將菌團中形成的孢子分散均勻利于下一步均勻接種。(2)發(fā)酵培養(yǎng)：50mL液體培養(yǎng)基裝入到250mL錐形瓶中，接種量為1mL，于25℃下170r/min振蕩培養(yǎng)[8]。

1.2.3分析方法

1.2.3.1生物量測定

冷凍干燥法測菌體干重，具體操作是將不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液將菌體轉(zhuǎn)移到預先稱量的冷凍干燥管中，進行冷凍干燥。

1.3.3.2EPA含量測定

(1)脂肪酸甲酯化：稱取20mg冷凍干燥菌體于具蓋玻璃試管中，加入4mL甲醇、濃硫酸、氯仿(體積比：1.7:0.3:2.0)混合溶液，并加入1mg內(nèi)標物，擰緊試管蓋，90℃條件下水浴40min，放置冷卻后加入1mL蒸餾水，搖晃30s，兩相生成，下相即為脂肪酸甲酯，將其加入離心管中，加入適量無水Na2SO4，1000r/min離心8min，用移液管將液體取出置于試管中用于氣相色譜分析。(2)氣相色譜分析①氣相色譜條件：色譜柱采用程序升溫：100℃升至220℃，每秒升10℃，220℃時保留5min。②EPA的定性分析：以十七烷酸(C17:0)為內(nèi)標[10]，在同一色譜條件下，以標準品色譜峰的保留時間與樣品色譜峰的保留時間對照進行分析。③EPA的產(chǎn)量分析EPAyield(mg/L)=ms/(Vs×1000)(1)式中：ms為樣品中EPA甲酯質(zhì)量，g；Vs為取樣體積，L。

2結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵時間對菌體生長的影響

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，在25℃，pH6.0條件下測定培養(yǎng)基中細胞干重，得到菌體生長曲線如圖1所示。Vs為取樣體積，L。

2結(jié)果與討論

2.1發(fā)酵時間對菌體生長的影響

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，在25℃，pH6.0條件下測定培養(yǎng)基中細胞干重，得到菌體生長曲線如圖1所示。實驗結(jié)果表明，菌體生長至80h時細胞干重達到最大值，之后細胞干重下降。因為脂質(zhì)積累時間通常是在菌體生長達到最大值之后，因此在實驗中取培養(yǎng)5d后菌體進行測定。

2.2EPA氣相色譜定量分析結(jié)果

以70g/L濃度的粗甘油為碳源，25℃，pH6.0條件下培養(yǎng)5d所得菌種按1.3.3所述實驗方法處理后，氣相色譜分析結(jié)果顯示，出峰時間10.0、15.5、16.5min分別為十七烷酸甲酯(內(nèi)標)、二十碳四烯酸甲酯(ARA甲酯)、二十碳五烯酸甲酯(EPA甲酯)，3種脂肪酸甲酯分離良好，并且其余組分不干擾測定，根據(jù)內(nèi)標物與EPA甲酯峰面積即可計算得到EPA產(chǎn)量。

2.3不同溫度對菌體生長及脂質(zhì)積累的影響

在pH6.0，轉(zhuǎn)速170r/min，粗甘油加入濃度70g/L的條件下，對溫度在15~35℃范圍內(nèi)菌體生長情況及EPA產(chǎn)量進行比較，發(fā)酵5d后，結(jié)果如表1所示。15、20℃菌體均形成光滑緊密的球團，且EPA含量較低，而25℃時，菌體分散成小米粥狀，且菌球直徑較小，細胞干重最大，EPA產(chǎn)量最高[11]；培養(yǎng)溫度在30、35℃時，菌體也分散生長，但細胞干重減小，EPA產(chǎn)量也較低。實驗表明，低溫不利于菌絲分散生長，溫度過高也不利于EPA的積累，因此，25℃是畸雌腐結(jié)果表明，在pH5.4~6.4條件下菌體生長情況及EPA產(chǎn)量變化不大，菌體均能較好生長，EPA積累也相差不大，但由圖可得較低pH值有利于菌絲中EPA積累。

2.5不同轉(zhuǎn)速對菌體生長及脂質(zhì)積累的影響

在25℃，pH6.0條件下，對轉(zhuǎn)速在160~180r/霉培養(yǎng)的最適溫度，此溫度下有利于菌體生長和EPA積累。

2.4不同pH對菌體生長及脂質(zhì)積累的影響

在25℃，轉(zhuǎn)速170r/min條件下，對pH在5～7范圍內(nèi)菌體生長情況及EPA產(chǎn)量進行比較，發(fā)酵5d后，結(jié)果如表2所示。min范圍內(nèi)菌體生長情況及EPA產(chǎn)量進行比較，發(fā)酵5d后，結(jié)果如表3所示。實驗表明，轉(zhuǎn)速對于菌體生長和EPA積累影響較大。轉(zhuǎn)速越高，菌體生長和EPA的累積越多。但是轉(zhuǎn)速上升到180r/min后，菌體和EPA的量變化不大。因為該菌體形狀為團塊狀，不利于發(fā)酵過程中的營養(yǎng)物質(zhì)以及氧的傳遞，只靠提高轉(zhuǎn)速不能很好解決傳質(zhì)問題。需要進一步改進發(fā)酵過程的混合方式。

2.6初始粗甘油濃度對菌體生長及脂質(zhì)積累的影響

在25℃，pH6.0，轉(zhuǎn)速170r/min條件下，對粗甘油加入濃度在20~90g/L范圍內(nèi)菌體生長情況及EPA產(chǎn)量進行比較，發(fā)酵5d后，結(jié)果如表4所示實驗表明，碳源濃度對于菌體生長和EPA積累影響較大，在低濃度時，由于不能滿足菌體生長所需碳源量，菌體不均勻分散，且細胞干重和EPA產(chǎn)量均較低。70g/L的粗甘油濃度最適宜菌體生長和EPA積累。

2.7以葡萄糖和廢甘油為碳源條件下的菌體生長及脂質(zhì)積累情況根據(jù)文獻記載，葡萄糖為發(fā)酵生產(chǎn)EPA的較佳碳源。在25℃，pH6.0條件下，分別以70g/L濃度的葡萄糖和粗甘油為碳源，發(fā)酵5d后，結(jié)果如表5所示。實驗表明，使用粗甘油為碳源可達到與葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)相似的生物量和EPA產(chǎn)量。因此可以用粗甘油代替葡萄糖作為發(fā)酵畸雌腐霉生產(chǎn)EPA的碳源。

3結(jié)論

論文在確定了EPA提取、檢測方法后對畸雌腐霉搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)EPA的過程進行了考察，確定了發(fā)酵生產(chǎn)EPA的較優(yōu)條件。結(jié)論如下。(1)利用粗甘油為碳源可以得到與葡萄糖為碳源發(fā)酵畸雌腐霉生產(chǎn)EPA獲得相似的產(chǎn)量，可以用粗甘油代替葡萄糖作為發(fā)酵畸雌腐霉生產(chǎn)EPA的碳源。

(2)菌體生長情況與EPA產(chǎn)量的關系：由實驗結(jié)果知，畸雌腐霉屬于凝集型菌。發(fā)酵過程中能形成菌球體，而菌體是否成球除了與是否為凝聚型菌有關外，還受培養(yǎng)條件：起始pH值，溫度等培養(yǎng)條件的影響。實驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時通氣量也能影響菌球體形成，較低轉(zhuǎn)速時形成較大菌球體，但受時間限制，沒有能最終確認最佳轉(zhuǎn)速。在利用粗甘油為碳源發(fā)酵畸雌腐霉生產(chǎn)EPA中，甘油濃度較低時菌體不能均勻分散；微酸性條件(pH5~6)菌絲能均勻分散，EPA含量較高，說明酸性環(huán)境有利于EPA的積累；溫度較低時菌體形成球團，較高溫度時能均勻分散。

(3)培養(yǎng)條件對畸雌腐霉生產(chǎn)EPA的影響：通過實驗研究了以粗甘油為碳源的培養(yǎng)基和發(fā)酵操作條件對畸雌腐霉發(fā)酵生產(chǎn)EPA的影響規(guī)律。采用單因素實驗的方式考察了粗甘油濃度、pH值、溫度等因素對畸雌腐霉生長和EPA產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：最適的初始粗甘油濃度為70g/L，較好的通氧條件有利于菌體生長；發(fā)酵液初始pH為6.0；畸雌腐霉的最適生長溫度是25℃。

(4)實驗表明，粗甘油作為生物柴油工業(yè)生產(chǎn)過剩的副產(chǎn)物，可以利用于發(fā)酵畸雌腐霉生產(chǎn)EPA，不僅可以滿足人們對于EPA日益增長的需要，還能解決合理利用廢甘油，降低生物柴油產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)成本，并保護環(huán)境。