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1α-葡聚糖酶的研究

1．1組成型α-葡聚糖酶工程菌的構(gòu)建及表達(dá)研究

梁達(dá)奉等克隆了朱黃青霉（PenicilliumminioluteumHI-4）的α-葡聚糖酶基因dex，構(gòu)建組成型表達(dá)載體pGAPZαA-dex；還以畢赤酵母KM71H為受體菌，構(gòu)建了組成型表達(dá)α-葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌KM71H／pGAPZαA-dex。他們的研究結(jié)果顯示，搖瓶發(fā)酵120h，α-葡聚糖酶酶活達(dá)到60．4U／mL。且該菌種培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，遺傳特性穩(wěn)定，在發(fā)酵過(guò)程中無(wú)需誘導(dǎo)，避免了甲醇的使用，這不但提高了安全性，還降低了成本，為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)α-葡聚糖酶打下基礎(chǔ)。

1．2酶學(xué)性質(zhì)及其穩(wěn)定性研究

黎志德等研究了KM71H／pGAPZαA-dex所產(chǎn)α-葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，α-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適反應(yīng)pH值為5．0；酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較好，pH值在4．5～5．0時(shí)α-葡聚糖酶較穩(wěn)定，4℃保存，半衰期約為35d。他們發(fā)現(xiàn)：采用葡萄糖作保護(hù)劑可以最大限度減少酶活損失，以蔗糖作為保護(hù)劑時(shí)，在室溫下酶活基本沒(méi)有損失；α-葡聚糖酶在pH值5．5時(shí)，溫度4～25℃保存150h，相對(duì)酶活仍有90％以上；但是當(dāng)貯存溫度超過(guò)30℃，酶活在較短時(shí)間明顯下降，且溫度越高，酶活下降速度越快；α-葡聚糖酶在pH值4～6，4℃下保存一周，相對(duì)酶活仍有80％以上；α-葡聚糖酶液中添加甘油濃度達(dá)到30％時(shí)，室溫下保存56d，相對(duì)酶活仍有80％以上。

1．3分離純化研究

黎志德等研究了α-葡聚糖酶在PEG-（NH4）2SO4雙水相體系中的分配行為，并從中尋找該雙水相體系中分離純化的最佳工藝條件。他們以兩相比、酶活、蛋白濃度、比活力以及萃取率為參數(shù)進(jìn)行比較，探討使用不同分子量的PEG、不同的PEG濃度以及不同（NH4）2SO4濃度下對(duì)酶分配行為的影響。發(fā)現(xiàn)，α-葡聚糖酶在質(zhì)量分?jǐn)?shù)13％的PEG4000以及13％的（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)中，可以獲得較高的比活力（2364．97U／mg）以及萃取率（99．94％）。

1．4制糖生產(chǎn)中添加α-葡聚糖酶的工藝條件研究

岑成福等通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化建立回歸模型，得到α-葡聚糖酶催化水解蔗汁中α-葡聚糖的最佳反應(yīng)條件：酶劑量0．05U／mL蔗汁、pH值5．3、反應(yīng)時(shí)間15min、反應(yīng)溫度51℃。在該條件下使用α-葡聚糖酶可將蔗汁中含量為800～900ppm的α-葡聚糖完全去除。

2α-葡聚糖酶在制糖工業(yè)的應(yīng)用研究

2．1在甘蔗制糖工業(yè)的應(yīng)用

在廣東某糖廠壓榨車間，蟻細(xì)苗等添加α-葡聚糖酶后測(cè)定蔗汁及糖漿中α-葡聚糖的含量，發(fā)現(xiàn)加酶后中和汁中α-葡聚糖減少約78．9％，粗糖漿中α-葡聚糖減少約64．4％。在廣西某糖廠的加酶試驗(yàn)結(jié)果表明，混合汁中α-葡聚糖減少約70．2％，中和汁中α-葡聚糖減少54．0％。抽查加酶前后每天兩個(gè)編號(hào)白砂糖樣品，發(fā)現(xiàn)加酶后白砂糖中α-葡聚糖的清除率達(dá)到95％，說(shuō)明加入α-葡聚糖酶能有效清除白砂糖中的α-葡聚糖，提高糖產(chǎn)品品質(zhì)。

2．2在原糖煉糖工業(yè)過(guò)程的應(yīng)用馬步等

在原糖煉糖企業(yè)的研究中發(fā)現(xiàn)，在煮糖過(guò)程加入α-葡聚糖酶有利于糖漿過(guò)濾。加酶后壓濾機(jī)的平均處理時(shí)間延長(zhǎng)了5．3％，說(shuō)明過(guò)濾流量降至需要卸泥的時(shí)間延長(zhǎng)了，而且每臺(tái)機(jī)器的處理量也增大了，日總處理量增加了7．6％。這可能是因?yàn)榧用负蟠蟛糠枝?葡聚糖在溶糖箱被降解，稀汁黏度下降，令過(guò)濾更加順暢；也可能是因?yàn)棣?葡聚糖被降解后改變了濾泥的結(jié)構(gòu)，令濾層阻力減少，增加了壓濾機(jī)處理量。在煮糖過(guò)程加入α-葡聚糖酶有利于煮煉收回。本實(shí)驗(yàn)所在精煉糖廠采用了七系煮糖法（煮糖罐編號(hào)分別為R1、R2、R3、R4、A、B、C。原糖溶解澄清后進(jìn)入R1煮糖罐，罐里的糖漿稱為R1糖漿，煮出來(lái)的糖膏稱為R1糖膏，分蜜后得出的糖為R1糖，蜜為R1蜜，R1蜜用作R2的糖漿，如此類推）。結(jié)果顯示，加酶后R1糖漿的簡(jiǎn)純度較加酶前上升了0．08％，這可能是因?yàn)樵翘菨{中的α-葡聚糖被降解后，原糖糖漿黏度下降，部分含雜質(zhì)的膠體體系被破壞，從而令過(guò)濾和脫色過(guò)程中清凈效率提高，使R1糖漿簡(jiǎn)純度提高。R3、R4、A、B和C糖漿的簡(jiǎn)純度均比加酶前下降，且A、B和C糖漿的下降幅度較大，這可能是由于前面兩系煮糖的結(jié)晶率提高，高純度物料前移，加酶后糖漿的α-葡聚糖含量明顯降低，從而降低了物料的粘度，加速了蔗糖的結(jié)晶速率，令糖漿的純度降低，從而提高了煮煉收回。理論上，α-葡聚糖的存在增加糖漿的粘度，影響蔗糖吸收、結(jié)晶速度，延長(zhǎng)煮糖時(shí)間，α-葡聚糖的除去可縮短煮糖時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，加酶后R1、R2糖漿純度提高，R1、R2糖的煮糖時(shí)間縮短，R3糖漿以后的煮糖時(shí)間也有相同規(guī)律，說(shuō)明加入α-葡聚糖酶還有利于縮短煮糖時(shí)間。

3展望

α-葡聚糖酶在糖廠的應(yīng)用結(jié)果表明，α-葡聚糖酶能有效降解蔗汁（或原糖糖漿）中的α-葡聚糖，提高清凈效果，提高過(guò)濾效率，提高加熱與蒸發(fā)過(guò)程的傳熱效率，增強(qiáng)煮糖物料循環(huán)流動(dòng)性，改善分蜜效果，降低廢蜜重力純度，提高煮煉收回；使用α-葡聚糖酶后，白砂糖中α-葡聚糖含量降至無(wú)法檢出，質(zhì)量和適用性顯著提高。目前，解決α-葡聚糖危害的最佳方法是利用α-葡聚糖酶在制糖工藝過(guò)程直接去除α-葡聚糖。該方法不僅效果好，而且安全環(huán)保，但是其不足在于酶活性不高，且生產(chǎn)成本較高?；蚬こ碳夹g(shù)和蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)將在提高α-葡聚糖酶酶活、提高熱穩(wěn)定性、增強(qiáng)底物特異性等方面發(fā)揮重要作用，成為今后的研究熱點(diǎn)。

作者：梁達(dá)奉馬步柳穎梁逸曾練強(qiáng)黃曾慰黃玉南林榮珍單位：廣西農(nóng)墾糖業(yè)集團(tuán)股份有限公司廣州甘蔗糖業(yè)研究所