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【摘要】目的檢測結(jié)直腸癌組織中E-鈣粘素的表達(dá)及其淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移,探討兩者間的關(guān)系。方法以CK20mRNA為標(biāo)記物,應(yīng)用RT-PCR對60例結(jié)直腸癌根治性手術(shù)切除的淋巴結(jié)標(biāo)本共782例進(jìn)行檢測;免疫組化法(SP法)檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移及正常對照組中E-鈣粘素的表達(dá)。通過二者的綜合分析,試圖發(fā)現(xiàn)抑癌基因E-鈣粘素在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為中的作用。結(jié)果CK20法檢出45例(75.0%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,陽性淋巴結(jié)總數(shù)為436個(55.8%);常規(guī)病理學(xué)檢出34例(56.7%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,檢出陽性淋巴結(jié)數(shù)為356個(45.5%);兩組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.72,P<0.05)。11例檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者癌組織中6例(54.5%)E-Cadherin表達(dá)陰性,而15例未檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移癌組織中僅有1例(6.67%)表達(dá)陰性,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.160,P=0.041)。結(jié)論E-Cadherin的表達(dá)減弱或消失參與了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌;E-鈣粘素;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

【Abstract】ObjectivePurposeTodetecttheexpressionofE-cadherinincolorectalcarcinomaandlymphnodemicrometastases,andinvestigatetheirrelationship.Methods82casesoflymphnodesimplewasdectectedwithRT-PCRmethodusingCK20mRNAacridiniumester.inscreeningcolorectalcarcinomalymphnodemicrometastases.E-Cadherinexpressionanalysedbyimmuno-histochemicalstaining(theSPmethod)incolorectalcancertissue,tissuenearbycancer,thenormalcontroltissue.ResultsIn60casesofcolorectalcarcinoma,theexpressionofE-Cadherinwas71.67%.Numberofpositivenodeswas55.8%,theexpressionofE-cadherinwas56.7%(34cases)andnumberofpositivenodeswas45.5%(356cases)throughroutinepathologicalexamination.ThelowlevelexpressionofE-CadherinwaspositivelycorrelatedwiththeDukesstaging,serosainfiltration,lymphnodeandlivermetastasisofcolorectalcarcinoma(χ2=16.72,P<0.05).TheexpressionofE-Cadherinwasnegativein6ofthe11patientswithlymphnodemicrometastases,andin6.67%1ofthe15patientswithoutlymphnodemicrometastases(χ2=4.160,P=0.041).ConclusionThenegativeexpressionofE-Cadherinmaycontributetolymphnodemicrometastasesincolorectalcarcinoma.

【Keywords】

colorectalcarcinoma;E-Cadherin;Lymphaticmetastasis;Rt-pcr

結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。每年有10%的惡性腫瘤患者死于結(jié)直腸癌[1,2]。術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌預(yù)后的最主要因素之一。在實施了根治性手術(shù)的結(jié)直腸癌患者中,仍有20%~50%的患者死于術(shù)后腫瘤的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3,4],有研究認(rèn)為該現(xiàn)象與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移有關(guān)。E-Cadherin粘附分子介導(dǎo)細(xì)胞粘附的紊亂涉及腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。E-Cadherin表達(dá)或功能的喪失與癌細(xì)胞喪失分化和較高的侵襲能力有關(guān)。本研究通過免疫組化方法檢測E-Cadherin粘附分子在結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá),以CK20為靶目標(biāo),應(yīng)用RT-PCR法檢測結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的微小轉(zhuǎn)移,以探討結(jié)直腸癌浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)與臨床分期、浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。探討結(jié)直腸癌組織中E-Cadherin的表達(dá)及其與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系,試圖對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移做出預(yù)測和早期診斷,為臨床治療提供依據(jù)和手段。

1實驗材料及方法

1.1實驗材料

1.1.1病例與標(biāo)本收集我院2005~2007年散發(fā)性結(jié)直腸癌根治術(shù)后標(biāo)本60例,其中男32例,女28例;年齡28~79,平均58.4歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療;剔除遺傳性非息肉病性散發(fā)性結(jié)直腸癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度:高分化23例,中分化21例,低分化16例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;TNM分期I期6例,II期26例,III期22例,IV期6例。術(shù)中采集散發(fā)性結(jié)直腸癌患者腫瘤周圍腫大淋巴結(jié)共782個,剖開,一半行常規(guī)術(shù)后病理,另一半保存于-80℃冰箱備用。選擇遠(yuǎn)癌“正常”大腸黏膜組織(距癌灶>4cm)和癌旁(距癌灶<2cm)大腸黏膜組織各10例作為對照觀察。所有標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者本人均簽署知情同意書。

1.1.2試劑鼠抗人E-Cadherin單克隆抗體和S-P試劑盒(Zymed公司)。TRIzolReagent(Invitrogen公司),TAKARAAMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司),TAKARALATaq(Takara公司),PCR試劑(Takara公司),DNA分子量Marker(晶美公司)。

1.2方法

1.2.1總RNA的抽提采用標(biāo)準(zhǔn)TRIzol法(參照說明書)提取術(shù)后淋巴結(jié)標(biāo)本的總RNA,凝膠電泳和分光光度計檢測RNA濃度和純度。

1.2.2cDNA制備總RNA樣品1μl,依次加入OligodT(18)0.5μl,MgCl22μl,10×RTBuffer1μl,RNaseFreedH2O3.75μl,10mmol/LdNTP1μl,RNaseInhibitor0.25μl,AMVReverseTranscriptase0.5μl?？偡磻?yīng)混合物于30℃反應(yīng)10min,42℃反應(yīng)30min,99℃反應(yīng)5min,5℃反應(yīng)5min。

1.2.3引物的合成在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找編碼人類基因CK20的核酸序列,其登錄號為NM_019010,該序列長1817bp,編碼序列CDS(CodingSequence)位于43-1317bp間。以此序列為基礎(chǔ),在CDS區(qū)內(nèi)設(shè)計引物。上游引物5’-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC-3’下游引物5’-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT-3’擴(kuò)增片段為449bp大小,引物由上海英俊公司合成。

1.2.4PCR反應(yīng)和分析采用RT-PCR方法,以人結(jié)直腸癌淋巴結(jié)cDNA為模版.反應(yīng)體系為50μl:cDNA模版1μl,10×LAPCR緩沖液5μl,25mmol/LMgCl25μl,20pmol/μl上游和下游引物各1μl,10mmol/LdNTPMixture2μl,LATag酶0.5μl,補(bǔ)去離子水至50μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環(huán);72℃再延伸5min。反應(yīng)完畢后進(jìn)行電泳分析。

1.2.5結(jié)直腸癌組織切片厚4μm,0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù),S-P免疫組化染色。染色步驟按說明書進(jìn)行,DAB顯色,蘇木精復(fù)染胞核。PBS代替第1抗體作陰性對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法資料的統(tǒng)計分析在SPSS13.0軟件包中進(jìn)行,數(shù)值變量以均數(shù)(95%可信區(qū)間)表示,計數(shù)資料用率來表示,兩組間率的比較采用χ2檢驗法。并采用診斷性實驗分析方法計算CK20與傳統(tǒng)病理切片技術(shù)診斷結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確度、敏感度和特異度。

實驗結(jié)果:

圖AE-Cadherin在正常大腸黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)40×

圖BE-Cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)40×

2結(jié)果

2.160例散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的782個受檢淋巴結(jié)經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查,34例(56.7%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,陽性淋巴結(jié)總數(shù)為356個(45.5%)。而采用RT-PCR法檢測CK20mRNA的表達(dá)情況來判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,結(jié)果顯示,45例(75.0%)患者有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,較病理學(xué)檢查結(jié)果新增11例,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.483,P=0.034)。陽性淋巴結(jié)總數(shù)為436個(55.8%),較病理學(xué)檢查結(jié)果新增80個,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.371,P<0.001)。

2.2E-Cadherin表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系E-Cadherin在癌組織中的表達(dá)陽性率顯著低于癌旁組織(P<0.05)。E-Cadherin低表達(dá)與結(jié)直腸癌Dukes分期、漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.311例檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者癌組織中6例E-Cadherin表達(dá)陰性,而15例未檢出微轉(zhuǎn)移癌組織中僅有1例表達(dá)陰性,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.160,P=0.041)。3討論

E-Cadherin又稱細(xì)胞-細(xì)胞粘附分子,廣泛分布于各類上皮細(xì)胞間介導(dǎo)同型細(xì)胞間連接的、具有鈣依賴性的粘附分子,其在胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、上皮極性和完整性等方面起到重要作用[5]。其表達(dá)程度及功能活性狀態(tài)直接影響細(xì)胞的脫落和再粘著,對維持組織結(jié)構(gòu)的完整性、極性及細(xì)胞分化等起重要作用[6]。其表達(dá)下降時細(xì)胞的粘附作用減弱,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[7]。

本研究表明,E-Cadherin在高分化型結(jié)直腸癌的表達(dá)明顯高于未分化型的結(jié)直腸癌,提示E-Cadherin與腫瘤的分化有關(guān),可作為分子標(biāo)記物來鑒別腫瘤的惡性程度。本組資料顯示E-Cadherin的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的病理組織類型無明顯相關(guān)性,主要考慮與各型腺癌結(jié)構(gòu)的分化和異型程度不一致造成,例如管狀腺癌就包括高、中、低分化三種類型。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為E-Cadherin是腫瘤浸潤抑制基因[8,9]。文獻(xiàn)報道,結(jié)直腸癌E-Cadherin表達(dá)異常與腫瘤分化及浸潤深度密切相關(guān),與本研究發(fā)現(xiàn)一致?？梢奅-Cadherin可以作為大腸癌的標(biāo)志物,協(xié)助判斷大腸癌的預(yù)后。

研究證明,淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后直接相關(guān)。CK20是一種獨(dú)特的I型細(xì)胞角蛋白,為具有嚴(yán)格的上皮特異性的癌細(xì)胞標(biāo)志物,可穩(wěn)定地存在于幾乎所有的胃腸道癌及其轉(zhuǎn)移癌中,正常血液及淋巴結(jié)的固有成分如淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞一般不表達(dá),是檢測直腸癌微轉(zhuǎn)移較特異的指標(biāo)[10,11]。我們應(yīng)用RT-PCR檢測CK-20陽性率為(55.8%),而傳統(tǒng)病理切片診斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率為(45.5%),兩組間有顯著性差異(P<0.001)。

11例檢出淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移患者癌組織中6例(54.5%)E-Cadherin表達(dá)陰性,而15例未檢出微轉(zhuǎn)移癌組織中僅有1例(6.67%)表達(dá)陰性,兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041)。本研究提示E-Cadherin的表達(dá)減弱或消失參與了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

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