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1IgY的提取與純化

卵黃作為特異抗體IgY的來源有許多優(yōu)點。如:母雞易于飼養(yǎng),費用不高;收集雞蛋方便,無需抽動物血,無損傷,符合現(xiàn)代動物保護(hù)規(guī)則;產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小,尤其是高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)對種系發(fā)生學(xué)上距離較遠(yuǎn)的禽類通常有較強(qiáng)的免疫原性。Carroll和Stollar(1983)[7]僅用總量30~475μg的增殖細(xì)胞核抗原,成功地產(chǎn)生雞抗弱免疫原性RNA多聚酶II的抗體。而Stuart等[8]分別用人胎盤膜及肝臟膜免疫,均獲得大量抗人胰島素受體和抗人胰島素樣生長因子1(IGF-1)受體。眾所周知,人肝膜僅含微乎其微的IGF-1,進(jìn)一步說明了免疫所需抗原量少。此前他們曾多次用相同的抗原免疫家兔均告失敗。完全福氏佐劑的使用使抗體持續(xù)時間長且產(chǎn)量高。

Gottstein和Hemmeler(1985)[9]的實驗表明,在一個月內(nèi)收集的提純IgY產(chǎn)量比兔血清高18倍。Gassmann等[10]用20~30μg增殖細(xì)胞核抗原初次免疫20天后出現(xiàn)特異IgY抗體,30天達(dá)高峰,并持續(xù)81天以上;卵黃中無其它Ig類,使得IgY易于提純等。此外,某些病原微生物如輪狀病毒,衣原體等可在雞胚中增殖。用這些感染的雞胚組織為抗原免疫雞獲取相應(yīng)抗體時,可省去抗原提純的復(fù)雜過程。但首先要找出有效、經(jīng)濟(jì)、簡便的提取方法,才能使IgY的應(yīng)用成為可能。近十幾年來,已建立了許多較為高效而經(jīng)濟(jì)的方法。這些方法大多以PEG[5]、硫酸葡聚糖[6]、自然膠,如藻酸鈉、角叉菜膠(Hatta等,1990)[11]或乙醇沉淀等方法初步純化工蛋白質(zhì)。產(chǎn)量約為每ml卵黃提取IgY5~7•5mg,純度87%~89%。Akita等在此基礎(chǔ)上建立了水稀釋法[12]。即以9份水稀釋1份卵黃,離心去除顆粒,再用硫酸鹽沉淀法濃縮,并經(jīng)超濾或乙醇沉淀或鹽沉淀進(jìn)一步純化、濃縮,再經(jīng)凝膠過濾提純,產(chǎn)量達(dá)9•8mgIgY/ml卵黃,純度94%。

此實驗中以PEG代替硫酸鹽沉淀,可進(jìn)一步提高產(chǎn)量。Bade和Stegemann(1984)用[13]預(yù)冷的丙烷和丙酮(-20℃)沉淀蛋白質(zhì)并去除脂質(zhì),經(jīng)DEAE柱層析進(jìn)一步純化,方法簡便、省時。其IgY抗體活性與用Polson法提純的IgY之間無明顯差別。且穩(wěn)定性好,經(jīng)3次以上凍融,抗體活性未見改變。Hassl和Aspock用疏水交換層析和凝膠過濾二步法分離提純IgY[14],雖然產(chǎn)量不及PEG或乙醇沉淀法,但活性相似,且純度較高。IgY的進(jìn)一步提純可用提純其它蛋白質(zhì)的方法。常見的有凝膠過濾、DEAE纖維素陰離子交換柱層析和親和層析等方法。必須指出,許多動物IgG均可用蛋白A親和分離。但I(xiàn)gY不能與蛋白A結(jié)合。McCannel和Nakai(1990)[15]用DEAE離子交換層析分離IgY亞群。在提高磷酸鹽離子濃度的同時,始終維持一定的pH值。固相金屬離子親和層析是一種蛋白質(zhì)純化技術(shù)。最常用的金屬離子有Cu2+、Ni2+,Co2-、Zn2+。研究表明Fe3+離子與磷酸化氨基酸有很強(qiáng)的親和力[16]。

結(jié)合于離子柱上的蛋白質(zhì)常通過降低pH值或提高鹽濃度或二者合并進(jìn)行洗脫。Greene和Holt[17]用固相金屬離子(Fe3+)親和層析,通過改變pH梯度,根據(jù)4個洗脫峰將IgY分為4個亞群。Marti等(1997)[18]將重組蛋白抗原結(jié)合于Ni-NTA柱上,用免疫親和層析純化特異IgY,效果良好。Kim等[19]用特異性IgY制成抗生物素蛋白質(zhì)-?；锼叵到y(tǒng)的親和層析柱,用于IgG的分離和提純。用不同的提取方法所得的IgY分子量也各異。Bizhanov比較了氯仿、萄聚糖藍(lán)(dextranblue,DB)和PEG三種提取IgY的方法,前者IgY產(chǎn)量比后二種方法高2~4倍;用SDS-PAGE分析其相應(yīng)產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)DB法提純獲得三種主要的蛋白成份:34•7KDa、41KDa和66Kda,并含少量45Kda成份:氯仿法提取主要含兩種蛋白成份:45•7KDa或75•2KDa;而用PEG提取獲得以66KDa為主的蛋白成份,氯仿及PEG法提取的蛋白質(zhì)中也包含少量41~80KDa的IgY[20]。

2在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

IgY的應(yīng)用與其生物學(xué)特性密切相關(guān)。在免疫診斷方面,由于IgY不激活補(bǔ)體、不結(jié)合類風(fēng)濕因子、不與蛋白A、蛋白G、哺乳動物Fc受體和補(bǔ)體結(jié)合,與IgG幾無交叉反應(yīng),故可作為免疫學(xué)實驗檢測工具,用于測定循環(huán)復(fù)合物、類風(fēng)濕因子和補(bǔ)體等,減少假陽性。

VanRegenmortel等[21]將雞補(bǔ)體C1和豚鼠補(bǔ)體C1混合,進(jìn)行定量微量補(bǔ)體結(jié)合試驗,解決了禽類補(bǔ)體難以固定的問題。該方法適用于檢測微量病毒抗原,測定病毒蛋白肽片段上的抗原活性或禽類血清抗體,可用于各種特異性病毒學(xué)檢測。Terzdo等以雙毛細(xì)管透析濃縮法提取特異性抗沙門氏菌腸出血型腸炎株IgY,用玻片菌體凝聚及試管鞭毛凝聚法測試了367株腸道菌和2株弧菌。結(jié)果該IgY只與沙門氏菌腸出血型腸炎株及其它抗原基因型相關(guān)的菌株起反應(yīng),表明可用此IgY檢測沙門氏菌腸出血型腸炎株[21]。αl-低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1,一種蛋白質(zhì))結(jié)合于一種含有HIF-1DNA結(jié)合位點的寡核苷酸。在基因核測方面,Camenisch等用HIF-1免疫并經(jīng)親和層析純化提取特異性IgY,根據(jù)電泳遷移率分析,用WesternBlot法測定人及哺乳動物細(xì)胞核提取液中的HIF-1,并用IgY抗體沉淀低氧細(xì)胞抽提液中的HIF-1,還在免疫熒光法中用此IgY測出定位于細(xì)胞核的HIF-1[23]。

由于如前所述卵黃作為特異抗體IgY的來源的許多優(yōu)點,IgY在免疫學(xué)檢測方面正在受到愈來愈廣泛的應(yīng)用。在免疫治療方面,因雞抗體耐酸、耐熱且性能穩(wěn)定,可經(jīng)口服用于預(yù)防或治療年幼動物或人類的腸道傳染病,如嬰兒防病食品,齲齒預(yù)防,新生乳豬致死性大腸桿菌感染的預(yù)防,以及魚病治療等。特別是抗生素或其它藥物的使用存在問題時,IgY成為首選。Farrely等用產(chǎn)毒性大腸桿菌免疫制備特異IgY抗體經(jīng)口給藥預(yù)防兔腹瀉病[24]。其中陰性對照組在用產(chǎn)毒性大腸桿菌攻擊后,72h內(nèi)全部發(fā)生嚴(yán)重腹瀉;實驗組在攻擊前4天開始喂飼卵黃,攻擊后未見明顯不良反應(yīng)。實驗還表明正常卵黃有部分保護(hù)作用:4只家兔喂以正常卵黃,其中3只發(fā)展為中度腹瀉,1只完全正常,不發(fā)病。該研究小組還進(jìn)行了體外實驗,表明1,IgY干擾E•coli與提純的小腸粘膜蛋白結(jié)合;2,IgY的此項干擾作用優(yōu)于雞血清IgG抗體。Yokoya-ma等[24]進(jìn)行了IgY經(jīng)口服抗感染的保護(hù)性試驗。

4日齡新生小牛經(jīng)口接種致死性傷寒沙門氏菌,并在同一天開始給予IgY口服,每日3次連服7~10天。結(jié)果對照組小牛全部死亡,低劑量IgY組死亡率60%~100%,高劑量組無一死亡,僅出現(xiàn)發(fā)熱或腹瀉,成功地用IgY抗小牛致死性傷寒沙門氏菌感染。Robert[26]用卵黃及其提取物成功地抑制組織細(xì)胞培養(yǎng)的輪狀病毒生長。在感染動物實驗?zāi)Ｐ椭?特異IgY可防止動物發(fā)展為輪狀病毒性胃腸炎,表明卵黃提取物可作為抗病毒抗體來源,防治嬰幼兒輪狀病毒腹瀉。IgY耐熱,經(jīng)巴氏消毒后活性依舊[27],這使卵黃制品的消毒及經(jīng)口服防病治病成為可能。在腫瘤研究方面,IgY也顯示出了可喜的應(yīng)用前景。甘露糖-6-磷酸酯/胰島素樣生長因子II受體(M6P/IGFII-R)與新合成的溶酶體酶的運(yùn)輸、IGFII的降解和TGFbaI的活性有關(guān),是哺乳動物中一種高度保守的蛋白質(zhì),由腫瘤抑制基因編碼,目前尚未有特異抗體可用于臨床研究。Lemamy等[28]由免疫的雞卵黃中提取特異性抗M6P/IGFII-R抗體,用于免疫過氧化物酶染色,見M6P/IGFII-R存在于乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞株(T47D,MDA-MB231,MCF7和BG1)的高爾基體中。另外還用于免疫組化法染色,分析了40份浸潤性乳腺癌冷凍切片中M6P/IGFII-R水平及其與腫瘤大小、惡化程度以及雌激素及孕激素的關(guān)系,提示M6P/IGFII-R水平在腫瘤細(xì)胞中明顯低究和效率不斷提高,IgY在醫(yī)學(xué)方面越來越顯示出不可估量的應(yīng)用前景。