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細(xì)菌、古菌16SrRNA克隆文庫的構(gòu)建和分析

經(jīng)觀察，樣品水中微生物細(xì)胞含量為1×103～1×104個(gè)/mL，估算實(shí)驗(yàn)需要800～1000mL地層水。用濾膜過濾地層水，收集菌體，提取總DNA。根據(jù)提取的DNA核酸濃度（6～11ng/μL）計(jì)算PCR擴(kuò)增的模板體積。樣品擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶（見圖2），這表明PCR反應(yīng)無明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象出現(xiàn)。然后切膠回收目的條帶，根據(jù)回收16SrRNA濃度（大于20ng/μL）準(zhǔn)確計(jì)算目的基因體積?？寺⊥瓿珊笸ㄟ^藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆。依據(jù)陽性克隆測序結(jié)果，同源性大于97%的16SrRNA序列歸于一個(gè)OTU。其中，杜6-3井樣品98個(gè)細(xì)菌克隆劃分為9個(gè)OTU，古菌129個(gè)克隆劃分為10個(gè)OTU。敖-7井樣品105個(gè)細(xì)菌克隆劃分為12個(gè)OTU，古菌104個(gè)克隆劃分為10個(gè)OTU。本文獲得的41個(gè)OTU序列的GenBank的登陸號(hào)為：JQ812008-JQ812048。利用軟件構(gòu)建細(xì)菌、古菌發(fā)育樹，算法采用Neighbouring-Joining方法。構(gòu)建細(xì)菌和古菌克隆文庫，分析地層水微生物群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)甲烷菌的構(gòu)成。杜6-3井樣品地層水中的細(xì)菌隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜酸菌屬（Acidovorax）、動(dòng)性桿菌屬（Planomicrobium）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、白色桿菌屬（Leucobacter）。其中假單胞菌屬微生物占74.49%，節(jié)桿菌屬微生物占16.32%，嗜酸菌屬和白色桿菌屬微生物所占比例均在4%左右（見表2）。因此，假單胞菌屬微生物為杜6-3井地層水中絕對優(yōu)勢微生物。張雪梅等[24]和吳亞曼等[25]在大慶油田地層水中、袁三青等[26]在勝利油田油井采出液中也都發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬微生物為優(yōu)勢菌屬微生物。杜6-3井樣品地層水中的古菌隸屬于甲烷桿菌屬（Methanobacterium）和甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）。其中，甲烷桿菌屬微生物為杜6-3井古菌中的絕對優(yōu)勢微生物，所占比例高達(dá)93.02%。因此，認(rèn)為杜6-3井地層水中起主要作用的微生物是假單胞菌屬微生物和甲烷桿菌屬微生物。敖-7井樣品地層水中的微生物種類也較少（見表3），水中的細(xì)菌隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、嗜氨基桿菌屬（Aminobacter）、甲基營養(yǎng)變形桿菌屬（Methylotrophicproteobacterium）、δ-變形桿菌屬（Deltaproteobacteria）、擬桿菌屬（Bacteroides）、節(jié)桿菌屬（Archrobacter）、海桿菌屬（Marinobacter）、嗜氫菌屬（Hydrogenophaga）以及古菌（Archaeon）。其中，假單胞菌屬微生物占44.76%，一種不可培養(yǎng)細(xì)菌占18.10%，嗜氫菌屬微生物占3.81%。敖-7井地層水樣品中的古菌屬于甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷食甲基菌屬（Methanomethylovorans）和甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）。其中，甲烷桿菌屬微生物占95.18%，為絕對優(yōu)勢古菌；甲烷食甲基菌屬微生物和甲烷八疊球菌屬微生物所占比例分別為1.92%和2.88%。

細(xì)菌、古菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

1細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和分析

基于16SrRNA基因信息繪制杜6-3井地層水中的細(xì)菌進(jìn)化發(fā)育樹（見圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹中的微生物群落劃分為4個(gè)類群，分別是：β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）。分析系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，與Du-6-3_B13同源相似性為99%的微生物屬于不可培養(yǎng)嗜酸菌屬微生物，其GeneBank的登錄號(hào)（以下簡稱登錄號(hào)）為NR026506；由于地層水的pH值顯示地層水中沒有積累大量的酸類物質(zhì)，因此推測微生物代謝過程中可能產(chǎn)生少量的酸類物質(zhì)，這些酸類物質(zhì)后來被微生物及時(shí)代謝分解。Du-6-3_B13同代謝季碳原子的已知微生物（登錄號(hào)：AJ012071）同源相似性也達(dá)到99%，因此推斷地層水中微生物利用烴類物質(zhì)參與代謝循環(huán)。Du-6-3_B11在菌群中占17.35%，與其同源相似性達(dá)99%的微生物（登錄號(hào)：JF727662）具有降解烴的能力，屬于變形桿菌綱。與Du-6-3_B12同源相似性達(dá)100%的已知菌（登錄號(hào)：HQ057683）屬于放線菌綱，參與碳、硫元素的循環(huán)代謝。Du-6-3_B30占菌群的1.02%，與動(dòng)性桿菌屬的已知微生物（登錄號(hào)：AJ697862）同源相似性達(dá)99%。綜上所述，地層水中微生物利用烴類物質(zhì)參與代謝循環(huán)，將小分子烴類部分轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，但這些酸類物質(zhì)迅速被嗜酸菌代謝分解，因此推測甲烷形成途徑主要為CO2還原途徑，為乙酸還原途徑的可能性較小。敖-7井地層水的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4）表明，地層水中的細(xì)菌分屬于6個(gè)類群，即：α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形桿菌綱（Betaproteobacteria）、δ-變形桿菌綱（Deltaproteobacteria）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）和古菌（Archaeon）。Ao-7_B2與降解苯的已知微生物Aminobactersp.（登錄號(hào)：AB691579）同源相似性達(dá)100%，Ao-7_B25與利用甲基的已知微生物Methylotrophicproteobacterium（登錄號(hào)：AF250404）同源相似性為100%，Ao-7_B37與已知鐵還原菌（登錄號(hào)：DQ677004）同源相似性為100%。據(jù)此推測，生物氣藏內(nèi)局部存在鐵還原反應(yīng)和利用苯及甲基物質(zhì)的代謝過程。嗜氫菌的存在表明，菌群協(xié)同作用可能會(huì)產(chǎn)生H2，H2被嗜氫菌利用進(jìn)一步參與代謝循環(huán)。因此，認(rèn)為生物氣藏中微生物能夠利用原油進(jìn)行新陳代謝，經(jīng)過諸多中間過程，最終通過CO2還原途徑形成甲烷，即甲烷形成途徑確定為CO2還原途徑。

2古菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析

杜6-3井樣品和敖-7井樣品中的古菌均可劃分為兩大類群（見圖5、圖6），即甲烷桿菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia），甲烷桿菌屬古菌為兩個(gè)樣品的絕對優(yōu)勢古菌。杜6-3井樣品中的古菌屬于甲烷桿菌屬（Methanobacteriumsp.）和甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）。甲烷桿菌屬微生物所占比例超過93%。相關(guān)研究表明[27]，甲烷桿菌屬微生物能夠利用CO2和H2為底物生產(chǎn)甲烷，不能利用乙酸進(jìn)行代謝。甲烷鬃菌屬微生物的乙酸為代謝底物生產(chǎn)甲烷。杜6-3和敖-7樣品中的甲烷食甲基菌屬、甲烷八疊球菌屬、甲烷鬃菌屬均屬于甲烷微菌綱。甲烷微菌可以利用甲酸鹽、酒精或者H2和CO2進(jìn)行代謝，它的存在說明氣藏環(huán)境中可能存在H2、CO2和有機(jī)酸等可供微生物代謝的電子供體[24]。

氣藏中微生物產(chǎn)甲烷途徑

杜6-3井和敖-7井地層水中微生物種類少。杜6-3井地層水中微生物包括石油降解微生物、作用于季碳原子的微生物、嗜酸微生物、甲烷桿菌和甲烷鬃菌；推測杜6-3井地層水中微生物菌群協(xié)同作用降解原油，形成少量酸類物質(zhì)，這些酸類物質(zhì)迅速被嗜酸菌代謝分解，因此甲烷為乙酸還原途徑成因的可能性較小。甲烷桿菌和甲烷鬃菌具備利用CO2和H2合成甲烷的潛力，甲烷的合成途徑可能是CO2還原途徑。敖-7井地層水中微生物包括甲基營養(yǎng)變形菌、嗜氫菌、苯降解微生物、甲烷桿菌、甲烷食甲基菌和甲烷八疊球菌。推測敖-7井樣品中的微生物可能具備利用烴類甲基參與新陳代謝的能力。嗜氫菌、甲烷桿菌、食甲基甲烷菌和甲烷八疊球菌等微生物具有代謝CO2和H2合成甲烷的潛力，因此推測敖-7井地層水中微生物菌群能夠降解烴類物質(zhì)，具備利用CO2和H2合成甲烷的潛力，生物甲烷形成途徑明確為CO2還原途徑。因此，適宜的條件下，杜6-3井和敖-7井中的微生物菌群均具備利用CO2轉(zhuǎn)化為甲烷的潛力。分子生物技術(shù)非培養(yǎng)分析方法往往能發(fā)現(xiàn)一些新種甚至新屬的16SrRNA基因序列。兩個(gè)樣品中的細(xì)菌、古菌克隆中同源性低于97%（最低的同源相似性僅為87%）的5條序列，極有可能是未被發(fā)現(xiàn)的新菌。這說明氣層微生物群落中存在未知的新微生物，這些微生物對甲烷代謝途徑的貢獻(xiàn)尚不清楚，對這類目前尚未培養(yǎng)的、未知菌的功能特性和生命活動(dòng)規(guī)律的了解還需更加深入的研究。

本文作者：魏小芳1,2秦積舜1,2帥燕華1,2劉可禹1,2,3羅一菁4史彥堯1,2張曙光1,2作者單位：1提高石油采收率國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2中國石油勘探開發(fā)研究院3澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究院地球科學(xué)與資源工程分部4中國石油大學(xué)（北京）重質(zhì)油國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室