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【關(guān)鍵詞】肉蓯蓉;1甲基4苯基吡啶離子;帕金森病;生存率

帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性變性疾病。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元已經(jīng)減少了60%～80%。盡管神經(jīng)科學(xué)家采取包括左旋多巴制劑在內(nèi)的各種治療方法，但目前所有的研究都提示無(wú)法阻止其進(jìn)展。生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（growtharrestandDNAdamageinducedgene153,GADD153）是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一種重要蛋白，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核［1］。本研究觀察了肉蓯蓉提取物對(duì)1甲基4苯基吡啶離子（1methyl4phenylpyridiniumion,MPP+）介導(dǎo)的SHSY5Y多巴胺能細(xì)胞系損傷的保護(hù)作用及對(duì)GADD153表達(dá)的影響，并探討了其對(duì)帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料肉蓯蓉提取物，上海市東方科技公司產(chǎn)品，PBS稀釋成10mg/ml，22μm濾膜過(guò)濾滅菌；MPP+，Sigma公司產(chǎn)品，無(wú)菌蒸餾水稀釋成4mol/L；胎牛血清、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco''''smodifiedeagle''''smedium,DMEM）、胰蛋白酶，均為Gibco公司產(chǎn)品；GADD153小鼠抗人單克隆抗體，SantaCruz公司產(chǎn)品；小鼠抗人βactin單克隆抗體，Sigma公司產(chǎn)品；甲基噻唑基四唑（methylthiazolyltetrazolium,MTT），荷蘭Duchefa公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RTPCR），MBI公司產(chǎn)品；SHSY5Y細(xì)胞，復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃芳老師惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組SHSY5Y細(xì)胞每2～3d用10%DMEM培養(yǎng)液換液1次。待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1×105分瓶傳代，置于5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞分為對(duì)照組、MPP+組和肉蓯蓉提取物不同濃度組。用DMEM培養(yǎng)液將MPP+按1∶10梯度稀釋成400mmol/L，按1∶100體積比例加入96孔板或6孔板中，使MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4mmol/L。肉蓯蓉提取物用DMEM培養(yǎng)液按1∶10梯度稀釋成1mg/ml與10μg/ml兩個(gè)工作濃度。按1∶100加入96孔板或6孔板中，使終濃度分別為1、10和100μg/ml。6孔板每孔總體積為2ml，96孔板每孔總體積為200μl。每項(xiàng)相同實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

1.2.2.1MPP+對(duì)SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響1×104密度SHSY5Y細(xì)胞200μl接種于96孔板，24h后換含MPP+終濃度分別為0.25、0.5、1、2和4mmol/L的培養(yǎng)液，每濃度3復(fù)孔，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育，分別于6、12、24和48h時(shí)各孔加入MTT20μl，繼續(xù)孵育4h取出培養(yǎng)板。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（dimethylsulphoxide,DMSO）150μl充分震蕩10min，待藍(lán)色顆粒完全溶解后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Biorad產(chǎn)品）570nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.2.2肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞損傷的影響終濃度1mmol/LMPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100μg/ml同時(shí)加入96孔板置5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育48h。其余步驟同1.2.2.1。

1.2.3RTPCR檢測(cè)GADD153的mRNA表達(dá)終濃度1mmol/LMPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100μg/ml，同時(shí)加入6孔板置5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，按Trizol法提取總RNA。取1μgRNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)總體積為25μl。引物序列為:GADD153上游引物，5’GCACCTCCCAGAGCCCTCACTCTCC3’；下游引物，5’GTCTACTCCAAGCCTTCCCCCTGCG3’；βactin上游引物，5’ATCGTGGGCCGCCCTAGGCAC3’；下游引物，5’TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGGC3’。擴(kuò)增目的產(chǎn)物的長(zhǎng)度分別為422bp和244bp。94℃預(yù)變性5min。循環(huán)參數(shù)為：95℃變性0.5min，60℃退火0.5min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物4μl，電泳后拍照。

1.2.4Westernblotting檢測(cè)GADD153蛋白表達(dá)終濃度1mmol/LMPP+與肉蓯蓉提取物分別為1、10和100μg/ml，同時(shí)加入6孔板置5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育48h。取出6孔培養(yǎng)板，PBS沖洗，加入60μl蛋白裂解液裂解，超聲震蕩，100℃變性10min。用Lowry法測(cè)定樣品蛋白濃度。電泳：積層膠60V30min，分離膠120V90min；PVDF膜轉(zhuǎn)膜110V100min。加1∶50小鼠抗人GADD153單克隆抗體，4℃過(guò)夜。TBST溶液洗滌3次，10min/次，加含HRP的兔抗小鼠二抗室溫孵育2h，化學(xué)發(fā)光法顯影X膠片。膠片用AlphaImage950自動(dòng)掃膠系統(tǒng)得到條帶灰度值。每個(gè)樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的βactin比較后作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示。

2結(jié)果

2.1MPP+對(duì)SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響不同濃度MPP+作用SHSY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞存活率隨MPP+的濃度增加而降低；MPP+1mmol/L濃度狀態(tài)下細(xì)胞存活率隨時(shí)間增長(zhǎng)而降低。呈現(xiàn)明顯的量效與時(shí)效關(guān)系。見(jiàn)圖1。其中MPP+1mmol/L組在48h存活率為（45.30±3.21）%，低于50%。故選用1mmol/LMPP+作為制作帕金森病細(xì)胞模型的處理劑量。

圖1不同濃度MPP+對(duì)SHSY5Y存活率的影響（略）

Figure1EffectsofdifferentconcentrationsofMPP+oncellviabilityofSHSY5Y

2.2;肉蓯蓉提取物對(duì)1mmol/LMPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞存活率的影響肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的損傷有明顯的保護(hù)作用。保護(hù)作用隨濃度增加而加強(qiáng)。MPP+1mmol/L處理的細(xì)胞48h存活率為（45.30±3.21）%，1μg/ml肉蓯蓉提取物處理的細(xì)胞存活率為（85.97±3.41）%，10μg/ml為（129.97±4.84）%，100μg/ml為（164.10±3.91）%，三種濃度與MPP+1mmol/L對(duì)照處理比較，細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。提示肉蓯蓉提取物不僅有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，而且還可能有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。見(jiàn)圖2。

2.3肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153mRNA表達(dá)的影響MPP+1mmol/L處理SHSY5Y細(xì)胞后，在膠上觀察到GADD153mRNA水平明顯較對(duì)照組明亮，統(tǒng)計(jì)出的結(jié)果也表明兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肉蓯蓉提取物組與MPP+1mmol/L處理組相比，GADD153mRNA水平不僅在膠上顯示出其隨著肉蓯蓉提取物濃度的增加而條帶逐漸變暗，對(duì)其掃描統(tǒng)計(jì)分析出的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，肉蓯蓉組GADD153的mRNA水平明顯降低（P＜0.01），且這種降低明顯呈肉蓯蓉劑量的依賴關(guān)系。見(jiàn)圖3。

圖2肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的保護(hù)作用（略）

Figure2ProtectiveeffectofCistancheextractsonMPP+inducedPDcellularmodel

AllthethreeconcentrationsofCistancheextracts(CE)hadaprotectiveroleonthe1mmol/LMPP+treatment.MPP+treatedcellshadalowerviabilityvscontrolgroup,andCistancheextractsgroupsexhibitedhigherviabilityvsMPP+group.**P<0.01,vsMPP+group;△△P<0.01,vscontrolgroup.

圖3肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153mRNA表達(dá)的影響

Figure3EffectsofdifferentconcentrationsofCistancheextractsonmRNAexpressionofGADD153ofMPP+inducedPDcellularmodel

mRNAexpressionofGADD153incontrolgroup,MPP+group(M),Cistancheextracts1μg/mlgroup(CE1),10μg/mlgroup(CE2)and100μg/mlgroup(CE3).mRNAexpressionofGADD153increasedtoasignificantlevelafterbeingtreatedby1mmol/LMPP+,whileCistancheextractsshowedexcellentcapabilityofdecreasingGADD153mRNAexpression.**P<0.01,vsMPP+group;△△P<0.01,vscontrolgroup.

2.4肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153蛋白表達(dá)的影響MPP+1mmol/L處理48h后，Westernblotting結(jié)果表明GADD153大量表達(dá)，膠片上的MPP+組印跡的著色明顯較對(duì)照組深，且這個(gè)結(jié)果與掃描統(tǒng)計(jì)后的分析結(jié)果一致（P＜0.01），而1、10和100μg/ml肉蓯蓉提取物卻逐漸降低了GADD153蛋白的表達(dá)，且這種表達(dá)與MPP+組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型GADD153蛋白表達(dá)的影響（略）

Figure4EffectsofdifferentconcentrationsofCistancheextractsonproteinexpressionofGADD153ofMPP+inducedPDcellularmodel

ExpressionofGADD153proteinincontrolgroup,MPP+treatedcells(M),Cistancheextracts1μg/ml(CE1),10μg/ml(CE2)and100μg/ml(CE3)pretreatedgroups.GADD153proteinexpressionofMPP+treatedcellsincreasedtoasignificantlevel,andCistancheextractspretreatmentdecreasedtheproteinexpressionbyasignificantlevel.**P<0.01,vsMPP+group;△△P<0.01,vscontrolgroup.

3討論

以往的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中占有很重要的地位［2,3］。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中，ATF6，IRE1和PERK三條通路都可以直接或間接地激活GADD153，進(jìn)而使正常細(xì)胞內(nèi)低水平表達(dá)的GADD153過(guò)量表達(dá)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4,5］。而GADD153敲除小鼠能減少甚至阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子剝奪所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡［6,7］。帕金森病的典型病理表現(xiàn)是中腦多巴胺能神經(jīng)元的減少，而這種減少目前認(rèn)為多與細(xì)胞凋亡有關(guān)［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在1mmol/LMPP+處理SHSY5Y細(xì)胞48h后，細(xì)胞的存活率已經(jīng)低于50%，而此時(shí)GADD153的mRNA和蛋白水平與對(duì)照組相比明顯增加（P＜0.01），這一結(jié)果也與Conn等［9］的發(fā)現(xiàn)相一致。因而GADD153的升高與細(xì)胞損傷之間有著緊密的聯(lián)系。肉蓯蓉提取物是從管花肉蓯蓉中分離、純化的一種化合物。中醫(yī)認(rèn)為肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便的功效，主治男子陽(yáng)痿、女子不孕、血枯便秘等證，有“沙漠人參”的美譽(yù)。以往的研究表明肉蓯蓉可以提高多種中樞神經(jīng)遞質(zhì)的含量，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，還可延長(zhǎng)動(dòng)物壽命和抗衰老。而對(duì)肉蓯蓉提取物的研究也表明肉蓯蓉的提取物具有抗凋亡的作用［10~12］。本實(shí)驗(yàn)的MTT結(jié)果表明1、10和100μg/ml肉蓯蓉提取物的細(xì)胞存活率均比MPP+組明顯增高（P＜0.01），而且細(xì)胞存活率與肉蓯蓉提取物濃度呈劑量依賴關(guān)系。因此我們的結(jié)果表明肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用。RTPCR和Westernblotting的結(jié)果顯示，GADD153的表達(dá)與對(duì)照組相比也明顯降低。其中在肉蓯蓉提取物最高濃度組（100μg/ml）GADD153mRNA水平降到了最低（P＜0.01），Westernblotting的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)GADD153的蛋白表達(dá)同時(shí)降到了最低（P＜0.01）?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為肉蓯蓉提取物對(duì)MPP+介導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)控GADD153來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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