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【關(guān)鍵詞】多腫瘤

癌癥是人類面臨的最大難題，隨著分子生物學(xué)和基因工程的進(jìn)展，使我們認(rèn)識到腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵是正常細(xì)胞內(nèi)基因組發(fā)生了改變，基因改變是導(dǎo)致腫瘤的根本原因［1］。近期的研究結(jié)果顯示從腫瘤的誘發(fā)到進(jìn)展是一個多階段、多因素的復(fù)雜過程，這個復(fù)雜過程包括腫瘤基因的激活和腫瘤抑制基因的失活，腫瘤基因和腫瘤抑制基因分別以正性和負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，并參與腫瘤的形成［2］。到目前為止，人類已發(fā)現(xiàn)100多個癌基因和10多種抑癌基因。80年代中期抑癌基因被發(fā)現(xiàn)以來，其重要作用得到廣泛認(rèn)可，抑癌基因(tumorsupressgene)是正常細(xì)胞在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因組結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、促進(jìn)細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面均有重要意義，它的缺失或失活可引起細(xì)胞內(nèi)癌基因(oncogene)的活化，造成細(xì)胞的過度增生、分化，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。癌基因和抑癌基因共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期活動的分子過程已為現(xiàn)今癌癥研究的重要課題之一。研究腫瘤發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，了解各種腫瘤細(xì)胞增殖周期中調(diào)控因子的狀況，對于進(jìn)行基因診斷、基因治療無疑具有重大意義。

1p16(MTS1)基因的發(fā)現(xiàn)和基本結(jié)構(gòu)

1992年美國Skolnick等在黑色素瘤患者中發(fā)現(xiàn)有與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)相結(jié)合的蛋白，但這種蛋白的基因未被克隆出，隨后對100個黑色素瘤細(xì)胞系采用染色體步移法和序列標(biāo)記位點(diǎn)圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1/2的腫瘤細(xì)胞在染色體9p21區(qū)發(fā)生頻繁的基因突變，推測該區(qū)域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在許多人類腫瘤集及體外細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)9p21區(qū)的缺失和突變。1993年，美國長島冷泉實(shí)驗(yàn)室研究的細(xì)胞先驅(qū)Serano等利用酵母雙雜和蛋白相關(guān)性篩選法(yeasttwo-hybridproteininteractionscreen)發(fā)現(xiàn)并分離了特異性的細(xì)胞周期素依賴性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，證明p16與CDK4結(jié)合后cyclinD/CDK4復(fù)合物的催化作用明顯降低，并克隆了p16的cDNA。1994年美國鹽湖城Kamb等［3］和圣地亞哥的Nobori［4］分別報道發(fā)現(xiàn)一個新的抑癌基因：p16，兩個研究小組發(fā)表了一項(xiàng)重要的研究成果發(fā)現(xiàn)一個新的抑癌基因：p16蛋白，證明p16與CDK4結(jié)合后cyclinD/CDK4復(fù)合物的催化作用明顯降低，并克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在對黑色素瘤染色體9p21易感區(qū)應(yīng)用物理圖(physicalmap)和序列標(biāo)記位點(diǎn)圖(sequencetaggedstites,STSs)分析了100個黑色素瘤細(xì)胞系的純合缺失，發(fā)現(xiàn)在兩個區(qū)域與Serrano報道的p16序列相近，命名為多發(fā)性腫瘤抑制因子1(multipletumorsuppress1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2與p16序列有93%相同，現(xiàn)命名為p15(kambA.S

cience,94,264,436-440)。p16基因位于人類的9號染色體短臂(9p21)上，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，外顯子1包括E1α和E1β，E1α，126bp；E1β，180bp；外顯子2307bp；外顯子311bp。全長8.5kb，氨基酸序列分析表明成熟的p16分子量為15.84kD的單鏈多肽，含有一個由148個氨基酸組成的開放閱讀框架，具有一個有4個ankyrin序列組成(回鉤狀重疊的空間構(gòu)型的蛋白結(jié)構(gòu))，這一構(gòu)型為維持其活性所必需，參與蛋白與蛋白之間的作用［4］。

2作用機(jī)制

細(xì)胞增殖分裂是細(xì)胞最基本的生理活動，越來越多的研究證明，細(xì)胞分裂周期的精確性及定時性是正常細(xì)胞生長和分化所必需的，細(xì)胞作為機(jī)體的最小單位，其生長過程總是處于一種增殖的動態(tài)平衡之中，這才能保證機(jī)體正常的生長、發(fā)育。這就意味著細(xì)胞內(nèi)必然存在著促進(jìn)和抑制增殖兩種體系［5］，包含于這一過程中的蛋白質(zhì)及基因的改變與腫瘤發(fā)生及其惡性表形密切相關(guān)。典型的一個細(xì)胞周期包括有嚴(yán)格順序的4個期即G1SG2M，它是由MPF(maturationpromotingfactor,MPF)所推動。并受到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和反饋環(huán)路的精密調(diào)控。MPF含兩種蛋白質(zhì)組分，其一為cdc2蛋白(celldivisioncycle2protein)，另一為細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，在整個細(xì)胞周期中cdc2蛋白的濃度是穩(wěn)定的，它的活動受到細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)，細(xì)胞是否進(jìn)入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取決于其能否順利通過若干關(guān)卡(checkpoints)，其中最重要的是G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換。前者又稱為“啟動點(diǎn)(start)”或“限制點(diǎn)(restrictionpoint)”，位于G1期末，DNA合成的起始，后者位于M期的初始?，F(xiàn)已證明，激活的CDK在這兩個轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用［6］。在高等的真核細(xì)胞，細(xì)胞周期蛋白分為A、B、C、D、E五種，它們分別在細(xì)胞周期的不同時期積累，激活相關(guān)細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期細(xì)胞周期蛋白是指在G1或G1/S交界處發(fā)揮作用啟動細(xì)胞周期并促進(jìn)DNA合成的周期蛋白，有C、D、E等多種，其中cyclinD1能激活CDK4、6調(diào)節(jié)G1/S轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞分裂周期由G1期進(jìn)入到S期，進(jìn)行DNA合成［7］，cyclinD實(shí)際上可以視為一種癌基因，其過度表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。最重要的研究發(fā)現(xiàn)是CDK抑制因子與腫瘤生長密切相關(guān)，對于CDK抑制因子p21的研究首先證明了這一點(diǎn)，p21是作為含有PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)在內(nèi)的CyclinD-CDK四聚體復(fù)合物中的一員在正常人纖維母細(xì)胞中首先被發(fā)現(xiàn)的［7］。對p16的研究進(jìn)一步闡明了CDK抑制因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。這就構(gòu)成了cyclins(細(xì)胞周期素)-CDKs(細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶，cyclinsdependentkinases)-CKIs(細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶的抑制蛋白，cyclinsdependentkinasesinhibitors)這一以CDKs為中心的細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。p16通過與cyclinD競爭結(jié)合CDK4、CDK6抑制cyclinD/CDK4的活性，參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，去除p16的抑制作用，將使細(xì)胞異常增殖，過度周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活，都會導(dǎo)致CDKs的過度作用，導(dǎo)致細(xì)胞非正常增生。野生型抑癌基因Rb的蛋白產(chǎn)物PRb的活性是通過磷酸化作用獲得的，CDK4、CDK6作為PRb的激酶與此密切相關(guān)，Liu等［8］提出PRb發(fā)生磷酸化后，導(dǎo)致與PRb結(jié)合的TF(TranscriptionFactor)的釋放，如E2F，E2F是通過激活與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因，如DNA合成酶-α，從而調(diào)控細(xì)胞周期由G1期到S期，E2F與未磷酸化的PRb結(jié)合時沒有轉(zhuǎn)錄活性，但與磷酸化的PRb分離后將激活p16基因轉(zhuǎn)錄，隨著p16mRNA水平的增多，和CDK4、CDK6結(jié)合的p16也增多，致使cyclinD/CDK4、CDK6的激酶活性受到抑制，低磷酸化的PRb為其活性狀態(tài)，PRb磷酸化水平下降，p16基因的錄也隨之降低［8］。JosephGeradts等［9］在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，在人類許多腫中，Rb過表達(dá)的細(xì)胞系都伴有p16表達(dá)下降，反之亦然。在p16過表達(dá)的細(xì)胞系無一例外地有Rb蛋白和/或p53蛋白失活，而Rb蛋白的失活對p16更有直接作用，Rb蛋白可抑制p16蛋白表達(dá)，進(jìn)一步影響cyclinD表達(dá)［10］。Beach等［11］認(rèn)為正常細(xì)胞中存在著一個由Rb、p16、cyclinD/CDK4、CDK6共同組成的反饋調(diào)節(jié)圈。p16在正常細(xì)胞調(diào)控周期中起負(fù)反饋?zhàn)饔?，p16基因影響Rb基因在細(xì)胞增殖中的調(diào)節(jié)作用，結(jié)合細(xì)胞周期的研究，在G1/S轉(zhuǎn)化過程中，PRb由于磷酸化失活，失活的PRb一方面促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，另外PRb通過轉(zhuǎn)錄因子，如E2F促進(jìn)p16的轉(zhuǎn)錄，反而又抑制cyclinD-CDK中間的反饋?zhàn)饔?，而達(dá)到對細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)變過程的調(diào)控。除此之外，p53對p16的表達(dá)也起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期抑制蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能分為兩類：一類包括p15、p16、p18、p19；另一類包括p21、p27。它們對細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用［8］。p16外顯子1包括E1α和E1β兩種，p16β是p16的另一個選擇替換轉(zhuǎn)錄模本，它由位于p16-exon1上游約15kb最新發(fā)現(xiàn)的短片段(exon1β)拼接至p16外顯子2、3上而成，那么就有可能產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：p16αmRNA和p16βmRNA［12］。Duro等［13］研究發(fā)現(xiàn)在B淋巴細(xì)胞位于9p21染色體p16外顯子1上游的一個片段(0.18kb)的嵌合轉(zhuǎn)錄模本，它可作為p16選擇拼接轉(zhuǎn)錄模本的一部分而被轉(zhuǎn)錄，它與編碼p16蛋白的開放閱讀框架(ORF)不一致，這種情況可能產(chǎn)生兩種蛋白，p16蛋白及另一截斷的p16蛋白(p16β蛋白)，分子量為1.38kD，p16β轉(zhuǎn)錄模本將能起始翻譯產(chǎn)生一種不同于p16的蛋白，盡管p16β角色有待闡明，日前的研究證實(shí)大鼠的p16β在腫瘤抑制作用中扮演重要角色。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)染p16βcDNA可抑制人或小鼠腫瘤的生長［13］。p16β轉(zhuǎn)錄模本在鼻咽部過度增生的上皮細(xì)胞及發(fā)生突變和過甲基化的鼻咽癌組織細(xì)胞中表達(dá)。Quelle［14］等轉(zhuǎn)染p16βcDNA到3T3成纖維細(xì)胞中而觀察到細(xì)胞周期停滯在G0～G1或G2～M期。Liggett［14］同樣通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染證實(shí)p16β和p16一樣具有生長抑制作用，并這種抑制作用不需要功能性的PRb的存在。鼠的p16β(p19ARF)比推斷的人類p16β蛋白長19個氨基酸，但目前還沒有人類細(xì)胞內(nèi)源性p16βmRNA翻譯產(chǎn)生蛋白的證據(jù)。

3p16基因及其產(chǎn)物在腫瘤中的失活機(jī)制

p16基因及其產(chǎn)物在人類許多原發(fā)性腫瘤和細(xì)胞株中發(fā)生改變，如腦腫瘤、頭頸癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等［15］均發(fā)現(xiàn)較高的p16基因的失活，主要失活機(jī)制有：突變、純合性缺失及5′CPG島甲基化失活等。(1)p16基因的突變包括無義突變、錯義突變和移碼突變。其突變部位主要在外顯子1和外顯子2。雖然大部分腫瘤細(xì)胞系中檢測到p16基因突變，但原發(fā)性腫瘤組織中除胰腺癌和食管癌及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤外，其他腫瘤p16基因突變率很低，SUN等［16］利用SSCP直接測序的方法在42例鼻咽癌和2個鼻咽癌細(xì)胞系均未發(fā)現(xiàn)p16基因的點(diǎn)突變，LO［17］等也發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性鼻咽癌及鼻咽癌的異種移植物中均未發(fā)現(xiàn)p16基因突變。Zhang等只檢測到4/68的原發(fā)性頭頸鱗癌和1/9的頭頸鱗癌細(xì)胞系中p16基因的點(diǎn)突變，所以點(diǎn)突變并不是p16基因失活的主要方式，且突變只有發(fā)生在編碼p16蛋白4個鉤狀重復(fù)結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)的DNA序列，才導(dǎo)致p

16蛋白失去對cyclinD/CDK的抑制作用，而蛋白羧基末端區(qū)對結(jié)合與抑制CDK活性并不重要。(2)Melo等［18］通過對一些細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤p16基因的研究發(fā)現(xiàn)p16基因的純合性缺失是p16基因在腫瘤中失活的主要機(jī)制，85%的惡性間皮瘤、82%的星形細(xì)胞瘤、70%～90%的腦膠質(zhì)瘤［13，16］、60%～70%的骨肉瘤、50%～60%的乳腺癌、胰腺癌和腎癌，25%～60%的惡性黑素瘤［19］、頭頸部腫瘤［16］和白血病20%～50%的膀胱癌［17］、肺癌［12，16］、卵巢癌和淋巴瘤的細(xì)胞系中發(fā)生純合性缺失。而在睪丸腫瘤、宮頸癌和結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞癌［12］細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)p16基因的純合性缺失。且發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腫瘤組織中p16基因的缺失率低于相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系［18］在乳腺癌［20］殖系腫瘤組織［21］未檢測出p16基因的改變。(3)DNA甲基化對于正常胚胎的發(fā)育是必需的，但它的異常卻能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)染色體區(qū)域性高甲基化與抑癌基因功能的丟失有關(guān)，可能是腫瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因啟動子區(qū)域5′CPG島甲基化常伴有基因的轉(zhuǎn)錄失活。CPG島是基因組C、G富集區(qū)，細(xì)胞中約有40%的基因啟動子區(qū)域具有CPG島［22］。正常情況下，除失活的X染色體［23］外，常染色體基因CPG島均處于非甲基化狀態(tài)，而在細(xì)胞癌變過程中(包括頭頸部腫瘤)常染色體基因CPG島存在廣泛的甲基化p16基因的外顯子1啟動子區(qū)域存在一CPG島，在被檢測的正常組織中它處于非甲基狀態(tài)。在一些p16等位基因較少發(fā)生點(diǎn)突變或純合性缺失的人類腫瘤中，如小細(xì)胞肺癌株出現(xiàn)高比例(78%)的5′CPG島甲基化而失去轉(zhuǎn)錄活性［24］；在乳腺癌(37%)、前列腺癌(60%)、腎癌(23%)細(xì)胞株中及原發(fā)性的乳腺癌(31%)和結(jié)腸癌(40%)也出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，特別是結(jié)腸癌細(xì)胞系中甲基化發(fā)生率高達(dá)97%，尤其是在一些未發(fā)生純合性缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞中，p16基因的兩個等位基因都出現(xiàn)異常甲基化，并與其完全失活是相關(guān)的［25］。后來又發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌病人的正常結(jié)腸黏膜也出現(xiàn)甲基化，這在正常細(xì)胞常染色體基因中是罕見的，一般島都是非甲基化的。p16基因的甲基化失活也發(fā)生在其他原發(fā)性人類腫瘤：包括膀胱癌、肺癌、頭頸部鱗癌［17，26］。由此可見，p16基因通常是通過純合性缺失和5′CPG島甲基化而失去抑制生長的功能。Merlo等［27］還發(fā)現(xiàn)，p16甲基化具有一定的基因特異性，在一些腫瘤細(xì)胞株中，位于染色體9p21與p16相鄰的p15/MTS2基因CPG島未見甲基化。p16甲基化發(fā)生于不同腫瘤的不同時期，p16甲基化發(fā)生于頭頸部鱗癌等惡性腫瘤的早期，可能具有早期腫瘤的診斷價值，而在食管癌的中晚期，與食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移及浸潤有關(guān)［28］。所以在進(jìn)行腫瘤分子篩選時只需測定其產(chǎn)物(如熒光免疫原位雜交、免疫組化)，較之測定基因結(jié)構(gòu)改變更為優(yōu)越。另一方面，不象突變和缺失等基因改變，甲基化基因改變是可逆的，如去甲基化劑5aZadC處理可誘導(dǎo)頭頸部癌和肺癌細(xì)胞株中p16的再表達(dá)［27］，并可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此，抑制基因甲基化的研究，對人類腫瘤的防止具有重要的意義。

p16甲基的失活機(jī)制與其他抑癌基因不同，不是通過丟失一個等位基因，繼之另一等位基因出現(xiàn)突變而失活，而主要表現(xiàn)為p16基因的純合性缺失和5′CPG島的甲基化。

4小結(jié)

p16作為一種抑癌基因，它有比以往所發(fā)現(xiàn)的任一種抑癌基因與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系更為密切、廣泛。其致癌機(jī)制更清晰、直接，它的作用對象單一，并且該基因小易于操作，p16可與其他抑癌基因如Rb、p53相互協(xié)調(diào)，共同抗癌。因此，以p16基因作為目的基因的基因替代治療，以及針對p16基因甲基化失活的治療，將在包括喉癌在內(nèi)的人類腫瘤的基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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