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摘要：【目的】觀察青藤堿（SINO）對佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠炎癥免疫功能的影響。【方法】選用SD大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，SINO低、中、高劑量組（劑量分別為60、120、240mg/kg），雷公藤多苷（TPT）組（劑量為30mg/kg）；除正常組外，其他組均采用弗氏完全佐劑足跖皮內(nèi)注射復(fù)制AA模型；各組于造模后第12天開始給藥，連續(xù)12d；觀察不同時間段的大鼠足趾腫脹度及關(guān)節(jié)評分；采用放射免疫法檢測滑膜細(xì)胞白細(xì)胞介素1β（IL1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）的含量；觀察各組大鼠滑膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組滑膜細(xì)胞IL1βmRNA、TNFαmRNA的表達(dá)。【結(jié)果】各劑量組SINO均可不同程度降低大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分，抑制滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL1β、TNFα，降低滑膜細(xì)胞IL1βmRNA、TNFαmRNA的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），恢復(fù)AA大鼠滑膜細(xì)胞的形態(tài)。【結(jié)論】SINO治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，恢復(fù)滑膜細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：青藤堿/藥理學(xué)；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕/中藥療法；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕/免疫學(xué)；滑膜細(xì)胞/超微結(jié)構(gòu)；

疾病模型，動物；大鼠

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病理基礎(chǔ)為關(guān)節(jié)滑膜炎，病因不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，嚴(yán)重危害了人類的身體健康。青藤堿（sinomenine，SINO）是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用［1-2］。本研究以佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠為模型，觀察SINO對AA大鼠滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及分泌炎性細(xì)胞因子的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1動物SD大鼠,普通級,體質(zhì)量180～200g，雄性，由安徽省醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供，合格證號：皖醫(yī)動準(zhǔn)01號。

1.2藥物及試劑青藤堿（湖南正清制藥廠生產(chǎn)，批號：0009101）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司提供，批號：031020）；RPMI1640粉（Sigma公司提供）；雷公藤多苷片（TPT，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：060503）；卡介苗（BCG，衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品，批號：20060101）；RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司產(chǎn)品）；125IIL1β放免試劑盒購于北京北方生物研究所，其他試劑為分析純。IL1β引物大小377bp，上游：5′TTGTGGCTGTGGACAAGCTG3′，下游：5′GCCGTCTTTCATACACAGGG3；TNFαmRNA引物大小249bp；上游：5′CTGGGCAGCGTTTATTCT3，下游：5′TTGCTTCTTCCCTGTTCC3；內(nèi)參照βactin引物大小147bp，上游：5′CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC3′，下游：5′CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG3′；以上引物均由上海生工公司合成。

1.3儀器JT12001型電子天平由上海精天電子儀器廠生產(chǎn)；YLSTA足趾容積測量儀由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn)；水套式CO2培養(yǎng)箱為美國SHELLAB產(chǎn)品；GL20A全自動高速冷凍離心機(jī)由湖南儀器儀表總廠離心機(jī)廠生產(chǎn)；YJ1450型醫(yī)學(xué)凈化工作臺由蘇州凈化設(shè)備公司生產(chǎn)；倒置式顯微鏡為日本Olympus產(chǎn)品；J1230型透射電鏡為日本電子公司產(chǎn)品；GC911型α放射免疫計數(shù)儀由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)中佳公司生產(chǎn)。

1.4分組、給藥及造模SD大鼠隨機(jī)均分為6組：正常組，模型組，SINO低、中、高劑量組（60、120、240mg/kg）和TPT組（30mg/kg），每組10只。按文獻(xiàn)報道造模［3］，除正常組外，其他各組均以弗氏完全佐劑（卡介苗80℃、1h水浴滅活后與高壓滅菌的液體石蠟充分碾磨混勻配成10mg/mL的乳劑）于每鼠左后足趾皮內(nèi)注射0.1mL致炎。各給藥組分別于致炎第12天開始灌胃給藥，連續(xù)12d，正常組及模型組給予等容積的溶媒。

1.5AA大鼠評價參照文獻(xiàn)［3］，采用足趾容積儀排水法測定右踝關(guān)節(jié)以下的容積（mL），分別于用藥前、用藥后第4、8、12、16天同法測量非致炎足的容積變化，以致炎前后差值表示其腫脹度（V腫脹）。多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分如下，0分：無腫脹；1分：1個趾關(guān)節(jié)受累；2分：多趾關(guān)節(jié)受累；3分：踝關(guān)節(jié)以下受累；4分：全爪受累。

1.6滑膜細(xì)胞培養(yǎng)致炎后第28天大鼠清醒狀態(tài)下股動脈放血處死。無菌取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織，滑膜細(xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)［4-5］方法進(jìn)行。以RPMI1640重懸細(xì)胞1×109個/L，取500μL細(xì)胞懸液和10mg/L脂多糖（LPS）500μL置6孔板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h，收集上清液，-20℃儲存，按125I放免試劑盒說明書方法進(jìn)行白細(xì)胞介素1β（IL1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）含量測定。

1.7透射電鏡檢查收集滑膜細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛Millonings緩沖液預(yù)固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，10g/L鋨酸固定2h，梯度乙醇逐級脫水；環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察攝像。

1.8滑膜組織IL1βmRNA、TNFαmRNA的檢測滑膜組織IL1β、TNFα總RNA提取采用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）［4］，用凝膠圖像分析儀掃描，LabImage3.2凝膠圖像分析軟件求出目的條帶灰度與內(nèi)參照βactin標(biāo)準(zhǔn)條帶的比值（p）。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS14.0軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1SINO對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響表1結(jié).2SINO對AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎影響表2結(jié)果顯示，致炎后第16天，模型組大鼠非致炎足關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫、變形，行走不便。SINO各劑量組均可顯著抑制AA大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)病變（P＜0.05或P＜0.01）。表1SINO對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較表2SINO對AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01，與模型組比較

2.3SINO對滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響滑膜組織中有兩型滑膜細(xì)胞，A型滑膜細(xì)胞起源于巨噬細(xì)胞，B型滑膜細(xì)胞起源于成纖維細(xì)胞。正?；そM織以B型細(xì)胞為主，其特征是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體較多；與正常組大鼠相比，AA大鼠則多見A型滑膜細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)囊泡增多，A型細(xì)胞含明顯的高爾基體和囊泡分散于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，線粒體腫脹、嵴突破壞；B型滑膜細(xì)胞數(shù)量減少。各給藥組大鼠以B型滑膜細(xì)胞為主，B型滑膜細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略有擴(kuò)張，但數(shù)量減少，少數(shù)線粒體腫脹，以SINO中、高劑量組和TPT組改善作用更為明顯，結(jié)果見圖1。

2.4SINO對IL1β、TNFα含量的影響表3結(jié)果顯示，模型組IL1β、TNFα高表達(dá)，而SINO中、高劑量組對AA大鼠滑膜組織IL1β、TNFα的生成有顯著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5SINO對滑膜IL1β及TNFαmRNA表達(dá)的影響表4結(jié)果顯示，正常組IL1β及TNFαmRNA低表達(dá)，模型組高表達(dá)（P＜0.05），SINO各劑量組均可不同程度降低IL1β及TNFαmRNA高表達(dá)（與模型組比較，P＜0.05或P＜0.01），且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。表3SINO對滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL1β、TNFα含量的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較表4SINO對IL1βmRNA、TNFαmRNA表達(dá)的影響統(tǒng)計方法：方差分析；①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

3討論

在RA的病理過程中，滑膜炎的一個重要特征是不能控制的滑膜細(xì)胞增殖，這種基質(zhì)成纖維樣細(xì)胞的增殖被認(rèn)為是"腫瘤樣"的，具有較大的破壞性且重復(fù)出現(xiàn)，最終侵襲軟骨，造成軟骨和骨的破壞［5］。滑膜組織和關(guān)節(jié)腔內(nèi)的A型滑膜細(xì)胞有吞噬異物的作用，占滑膜細(xì)胞總數(shù)的10%左右；B型滑膜細(xì)胞為主要的滑膜細(xì)胞，能合成和修飾所有的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和滑液成分，其分泌的透明質(zhì)酸在潤滑關(guān)節(jié)、營養(yǎng)肌腱等方面發(fā)揮重要作用,具有較強(qiáng)的損傷修復(fù)能力［7］。通過對各組滑膜組織超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)SINO能顯著增加B型滑膜細(xì)胞的數(shù)量，同時降低A型滑膜細(xì)胞的數(shù)量，提示SINO在調(diào)節(jié)炎癥致滑膜細(xì)胞分化異常，促使炎癥修復(fù)方面起著一定的作用。

RA中的滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，可合成IL1β與TNFα等多種炎性細(xì)胞因子。釋放入關(guān)節(jié)滑膜液及血液中的細(xì)胞因子IL1β與TNFα有許多相似的生物學(xué)活性，如促進(jìn)滑膜纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生成膠原酶和前列腺素，誘導(dǎo)糖蛋白的分解與骨的吸收，抑制糖蛋白的合成與骨的形成，刺激B型滑膜細(xì)胞增生，使滑膜增厚，生成大量基質(zhì)金屬蛋白酶等［6］。從功能上分析，分布于A型滑膜細(xì)胞內(nèi)的高爾基復(fù)合體參與分泌活動，線粒體則為細(xì)胞代謝提供能量；B型滑膜細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有分泌蛋白質(zhì)等功能［8］。本研究通過對不同類型滑膜細(xì)胞具有分泌、代謝功能的細(xì)胞器進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA模型組在致炎后28d時，滑膜細(xì)胞的代謝活性及IL1、TNFα分泌功能均有所亢進(jìn)；各治療組A、B型滑膜細(xì)胞中高爾基體、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡的數(shù)量均有所減少，表明SINO可降低亢進(jìn)的滑膜細(xì)胞功能，保護(hù)滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而減輕滑膜細(xì)胞變性。在本研究中，AA大鼠滑膜細(xì)胞釋放較高水平的IL1β、TNFα，SINO可抑制IL1β、TNFα的產(chǎn)生，下調(diào)致炎因子IL1mRNA、TNFαmRNA的表達(dá)。表明SINO可通過降低AA大鼠滑膜細(xì)胞活化而減輕繼發(fā)性炎癥，該抑制滑膜細(xì)胞分泌亢進(jìn)的功能與透射電鏡觀察到滑膜細(xì)胞具分泌功能細(xì)胞器形態(tài)改變的結(jié)果一致。因此，SINO治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用可能與其能抑制滑膜細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，恢復(fù)滑膜細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。

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