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【關(guān)鍵詞】戰(zhàn)骨；,,黃毛豆腐柴；,,指紋圖譜；,,高效液相色譜法；,,壯藥

摘要：目的采用高效液相色譜法對(duì)壯藥戰(zhàn)骨藥材進(jìn)行指紋圖譜的研究，為戰(zhàn)骨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)采用PhenomenexGeminiC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.05mol/L醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)274nm。結(jié)果以23個(gè)共有峰為評(píng)價(jià)指標(biāo)，精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，符合有關(guān)規(guī)定要求。結(jié)論此方法操作簡(jiǎn)單，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，有助于戰(zhàn)骨藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：戰(zhàn)骨；黃毛豆腐柴；指紋圖譜；高效液相色譜法；壯藥

Abstract：ObjectiveThefingerprintchromatogramswereestablishedforqualityevaluationoftraditionalZhuangnationalitymedicineZhangu(therootofPremnafulvacraib)byhighperformanceliquidchromatography.MethodsTheanalysiswasperformedonaPhenomenexGeminiC18column（4.6mm×250mm,5μm）withacetonitrile0.05mol/Lethanoicacidasmobilephaseinagradientmodeataflowrateof1.0ml/min,andatacolumntemperatureof25℃.Thedetectionwavelengthwas274nm.ResultsTwentythreepeakswereselectedasthecommonfingerprintpeaks.Therelativestandarddeviationsforrelativeretentionvaluesandrelativepeakareaswerelessthan3%論文網(wǎng)在線

Keywords：Zhangu；PremnafulvaCraib.；Fingerprint；Highperformanceliquidchromatography；TraditionalZhuangNationalitymedicine

壯藥戰(zhàn)骨是馬鞭草科植物黃毛豆腐柴PremnafulvaCraib.的干燥莖，別名土霸王、穿云箭［1］。多分布于廣西百色、南寧地區(qū)等地，藥源豐富，價(jià)廉易采收，屬可持續(xù)利用的天然藥物資源。戰(zhàn)骨具有活血散淤、強(qiáng)筋健骨、驅(qū)風(fēng)止痛的功效，廣西民間常用于治療腰腿痛、跌打損傷、風(fēng)濕性和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及感冒身痛、淋巴結(jié)炎、肝區(qū)疼痛等［2～4］。戰(zhàn)骨中含有多種化學(xué)成分，其主要有效成分為柚皮素等黃酮類化合物［5～7］。由于受產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境等因素的影響，不同藥材所含有效成分差異較大。針對(duì)中藥材的某個(gè)有效成分對(duì)藥材進(jìn)行定性、定量并不能有效控制中藥材的質(zhì)量。指紋圖譜能夠從綜觀和整體上表征中藥材的特征，目前已成為國(guó)際上公認(rèn)的控制天然藥物質(zhì)量的有效手段［8，9］。本文以提高戰(zhàn)骨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)民族醫(yī)藥發(fā)展為目的，對(duì)廣西不同產(chǎn)地戰(zhàn)骨藥材進(jìn)行了指紋圖譜的研究。

1材料與方法

1.1儀器與藥品儀器：美國(guó)PerKinElmer公司Series200高效液相色譜儀（包括Series200紫外檢測(cè)器、Series200二元泵、600Series接口及色譜工作站）。PhenomenexGeminiC18色譜柱（4.6mm×250mm,5μm）。藥材：戰(zhàn)骨（產(chǎn)地：廣西，經(jīng)廣西南寧食品藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定，均為馬鞭草科植物黃毛豆腐柴的干燥莖。來(lái)源見(jiàn)表1）。試劑：乙腈、甲醇為色譜純，乙醇、醋酸為分析純，水為高純水，柚皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

表1戰(zhàn)骨藥材樣品來(lái)源及批號(hào)（略）

1.2色譜條件以乙腈-0.05mol/L醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行二元梯度洗脫，流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)274nm，進(jìn)樣量20μl。梯度洗脫程序結(jié)果見(jiàn)表2。

表2流動(dòng)相梯度洗脫程序（略）

1.3方法

1.3.1參照物溶液的制備取柚皮素對(duì)照品適量，用甲醇溶解，定容，作為參照物溶液（含柚皮素104μg/ml）。

1.3.2供試品溶液的制備取各批戰(zhàn)骨藥材粉未（過(guò)2號(hào)篩）約2.5g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入30%乙醇溶液50ml，超聲處理1.5h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。不立即分析的樣品可暫存于4℃的冰箱保存。

1.3.3測(cè)定方法分別精密量取參照物溶液和各供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄90min色譜圖即得。以柚皮素的色譜峰（S）的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其它各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1精密度以1#藥材制備供試品溶液，在“1.2”項(xiàng)下色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果表明，色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.98%；相對(duì)峰面積的RSD小于2.31%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.1.2重復(fù)性以1#藥材5份，制備供試品溶液，分別檢測(cè)指紋圖譜，結(jié)果表明各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.91%；單峰面積大于等于5%總峰面積的色譜峰其相對(duì)峰面積的RSD小于2.28%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.3穩(wěn)定性取1#藥材制備供試品溶液，分別在0，12，17，37，48h檢測(cè)指紋圖譜，結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于2.51%，相對(duì)峰面積比值的RSD小于2.89%，表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2指紋圖譜的建立及分析

2.2.1指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定對(duì)10個(gè)戰(zhàn)骨藥材樣品進(jìn)行了測(cè)定，其色譜圖有23個(gè)主要的共有特征峰（占總峰面積的90%以上）。其典型的HPLC-UV指紋圖譜見(jiàn)圖2。其中17號(hào)峰為柚皮素（與參照物對(duì)照確認(rèn)，色譜圖見(jiàn)圖1）。10批樣品中，單峰面積與總峰面積的比值大于20%的共有峰只有17號(hào)峰，大于10%的共有峰有21號(hào)峰，大于5%的共有峰有1號(hào)和4號(hào)峰。結(jié)果表明1，2，3………23號(hào)峰在10批樣品的色譜圖中均出現(xiàn)。以柚皮素對(duì)照品保留時(shí)間為參照，計(jì)算各共有特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于2.10%（n=10，結(jié)果見(jiàn)表3）。因此標(biāo)定此23個(gè)峰為共有指紋峰，并據(jù)此建立戰(zhàn)骨藥材的HPLC指紋圖譜。

表310批戰(zhàn)骨藥材共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間（略）

2.2.2共有指紋峰面積與參照物峰面積的比值以柚皮素峰面積為參照，計(jì)算各批藥材供試品共有指紋峰的峰面積比值，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4和圖3可見(jiàn)，各批供試品指紋圖譜的重現(xiàn)性較好，但各批樣品間共有指紋峰的相對(duì)峰面積有一定差異。

2.2.3非共有峰面積供試的10批樣品共有指紋峰面積之和占總峰面積比值平均為93.69%，則非共有峰面積占總峰面積的比值平均為6.31%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》［10］。

2.3指紋圖譜的檢驗(yàn)取10批戰(zhàn)骨藥材，按供試品溶液的制備方法操作，分別取各批藥材制成的供試品溶液，按供試品檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，并與典型的指紋圖譜相比較，結(jié)果表明各批樣品指紋圖譜相似度較好，共有23個(gè)共有峰，而且各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%。結(jié)果見(jiàn)圖3及表3。

3討論

3.1實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了多種流動(dòng)相系統(tǒng)：①甲醇-水，②甲醇-醋酸水溶液，③乙腈-水，④乙腈-醋酸水溶液等度和梯度洗脫幾種方式，并對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明以“1.2”項(xiàng)下系統(tǒng)為最佳。各色譜峰分離度較好，峰型尖銳，保留時(shí)間適中。

3.2實(shí)驗(yàn)中對(duì)戰(zhàn)骨藥材供試品溶液進(jìn)行紫外掃描，在274nm和280nm有最大吸收。分別在254，274，280nm和288nm［11］波長(zhǎng)下測(cè)定指紋圖譜，從色譜圖中的基線、峰型和分離度等因素綜合考慮，選擇274nm為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

表410批戰(zhàn)骨藥材共有指紋峰的相對(duì)峰面積（略）

3.3不同產(chǎn)地的戰(zhàn)骨藥材指紋圖譜相似度較高，23個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間符合程度較好，但相對(duì)峰面積有一定差異。提示藥材應(yīng)在固定產(chǎn)地的前提下才能保證藥品的一致性，同時(shí)說(shuō)明以簡(jiǎn)單測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)成分含量為主的傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法已不能真正反映中藥材質(zhì)量，而利用指紋圖譜對(duì)藥材進(jìn)行綜合、宏觀地評(píng)價(jià)是當(dāng)今對(duì)天然藥物質(zhì)量控制的有效手段。論文網(wǎng)在線

3.4本實(shí)驗(yàn)所建立的方法，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求［10］，為壯藥戰(zhàn)骨及制劑的質(zhì)量控制提供了一定的科學(xué)依據(jù)，對(duì)壯藥戰(zhàn)骨藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升進(jìn)行了有益的探索。

圖1柚皮素HPLC圖譜（略）

圖2戰(zhàn)骨藥材HPLC指紋圖譜（樣品1#）（略）

圖310批戰(zhàn)骨藥材HPLC指紋圖譜（略）

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