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【關(guān)鍵詞】大青葉

SFEtechnologyofindirubinfromDaqingyeandcontentdeterminationofindirubin

【Abstract】AIM:TouseHPLCforthecontentdeterminationofindirubininsupercriticalfluidextraction(SFE)materialfromDaqingyeandtooptimizetheprocessofSFE.METHODS:Contentofindirubinwasusedasindextoevaluatethetechnologiesbasedonorthogonaldesign,inwhich4factorsconsideredwereextractiontemperatureandpressure,separationtemperatureandpressure.AHPLCsystemwasusedtodeterminethecontentofindirubin.RESULTS:Optimalprogramwasasfollows:extractiontemperature50℃andpressure40MPa,separationtemperature40℃andpressure8MPa.Theaveragerecoveryofindirubinwas102.8%andRSDwas1.48%.CONCLUSION:Theextractiontemperature,extractionpressureandseparationpressureallhavesignificanteffectsontheextractionrateofindirubin.TheHPLCmethodissimple,preciseandsuitableforthecontentdeterminationofindirubininSFEmaterialofDaqingye.

【Keywords】Daqingye;SFECO2;indirubin;chromatography,highpressureliquid

【摘要】目的：建立用HPLC測定大青葉的超臨界萃取物中靛玉紅含量的方法，對萃取工藝進行優(yōu)選.方法：采用超臨界萃取法進行L9(34)正交實驗.以靛玉紅含量考察萃取溫度、萃取壓力、分離溫度及分離壓力四個因素的影響.采用HPLC法測定萃取物中靛玉紅含量.結(jié)果：最佳萃取工藝為萃取溫度50℃,萃取壓力40MPa,分離溫度40℃及分離壓力8MPa.靛玉紅平均回收率為102.8%，RSD為1.48%.結(jié)論：萃取溫度、萃取壓力及分離壓力對大青葉中靛玉紅的萃取都有顯著影響.HPLC法操作簡便，結(jié)果準確，可作為超臨界萃取大青葉中靛玉紅的質(zhì)量控制方法.

【關(guān)鍵詞】大青葉；CO2超臨界萃?。坏逵窦t；色譜法，高壓液相

0引言

靛玉紅主要來源于植物馬藍(Baphicacanthuscusia)、蓼藍(Polygonumtinctorium)及菘藍(Isatisindigotica)的中藥材如大青葉、板藍根、青黛等，靛玉紅是其主要有效成分.靛玉紅有治療慢性髓性白血病作用，是一種應(yīng)用前景廣闊的抗腫瘤成分［1］.

靛玉紅在中藥材中含量很低，為減少藥物使用量，提高生物利用度，我們用超臨界流體萃?。⊿FE）法對大青葉中的靛玉紅進行分離提純，同時建立萃取物中靛玉紅含量的HPLC測定方法，優(yōu)化靛玉紅SFE工藝.

1材料和方法

1.1材料GoldenSystem高效液相色譜儀（美國Beckman公司），配125型高壓雙泵，168型二極管陣列檢測器；色譜柱:SynersiFusionRP柱（4.6mm×250mm，4μm，美國Phenomenex公司）；FY2215006超臨界萃取儀（南通市飛宇石油科技開發(fā)有限公司）；R200D電子分析天平（德國Satorius公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAASPIRATORA3SRIKAKIKATCO.LTD）.大青葉購自西安藥材市場，按照中國藥典（2005年版）有關(guān)大青葉項下鑒定本品為合格藥材；靛玉紅對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號717200204；甲醇為HPLC級（美國FISHER公司），水為超純水，其余試劑均為AR級.

1.2方法

1.2.1SFE正交實驗設(shè)計采用L9(34)設(shè)計，選擇萃取溫度、萃取壓力、分離溫度及分離壓力四個因素，每個因素取3水平.分別為萃取溫度40,50及60℃；萃取壓力20,30及40MPa；分離溫度30,40及50℃；分離壓力8,10及12MPa.

1.2.2供試品溶液的制備打開超臨界萃取儀，按1.2.1的設(shè)計設(shè)置萃取儀溫度參數(shù)，預(yù)熱完畢后將精密稱取的大青葉50g放入萃取缸Ⅱ，按1.2.1的設(shè)計將壓力值調(diào)整到需要的參數(shù)，同時向副泵系統(tǒng)下的夾帶劑缸中加入氯仿100mL，開動副泵，開始萃取.每半小時收集一次分離液，至2h內(nèi)連續(xù)收集不到液體時停止該次實驗.將收集到的分離液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，用甲醇定容于10mL容量瓶中，作為供試品溶液.

1.2.3色譜條件以甲醇0.015mol/L醋酸銨（72∶28）（用醋酸以1∶150的比例調(diào)節(jié)pH值）為流動相；流速為1.0mL/min；檢測器靈敏度：1.0AUFS；柱溫20℃；檢測波長289nm.理論板數(shù)按靛玉紅峰計算不低于4000.對照品及樣品色譜圖不同(圖1,2).

圖1靛玉紅對照品的色譜圖（略）

圖2樣品色譜圖（略）

1.2.4線性考察精密稱取靛玉紅對照品10mg，用甲醇定容于50mL容量瓶中，超聲5min，制成0.2g/L的對照品溶液，分別精密吸取該對照品溶液3,2,1,0.5及0.2mL于5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度.各取以上5個對照品溶液20μL進樣于HPLC系統(tǒng)中，以色譜峰面積對靛玉紅進樣濃度作線性回歸，得回歸方程Y=10.83427+0.68547X,r=0.9994.靛玉紅在8~120mg/L內(nèi)，線性關(guān)系良好.

1.2.5精密度測定取線性關(guān)系中同一對照品液連續(xù)進樣5次，每次20μL，靛玉紅峰面積RSD為1.74%.

1.2.6穩(wěn)定性實驗將同一供試品液在0,1,2,4,12h各進樣一次測試峰面積，結(jié)果RSD為2.65%，表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.7重復(fù)性實驗取同一供試品液5份，依法測定，結(jié)果靛玉紅平均含量為17.33μg/g，RSD為2.07%.

1.2.8加樣回收率實驗精密量取已知含量的同一供試品液3份，每份1mL，分別精密加入0.4mL濃度為0.04g/L的對照品溶液，按樣品含量測定方法操作，平均回收率為102.8%,RSD為1.48%.

1.2.9樣品測定精密吸取上述正交實驗提取的供試品溶液各20μL進樣,按1.2.3色譜條件進行測定.

2結(jié)果

外標法計算靛玉紅含量（表1），并計算每個因素每水平的靛玉紅含量（表2）.

表1不同工藝的靛玉紅含量（略）

表2每個因素每水平的靛玉紅含量（略）

K值為每因素每水平的三個值之和，如K1為每因素水平為1時的三個值的和，余同.R為級差，即K1,K2和K3三個值中最大值與最小值之差.

對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果萃取溫度、萃取壓力及分離壓力對靛玉紅的回收率均有顯著影響（P<0.05）.將級差R值依大小排列，則影響靛玉紅含量的四因素主次順序為萃取溫度>萃取壓力>分離壓力>分離溫度.以每個因素每水平的K值中的最大值得知：最佳工藝為萃取溫度50℃、萃取壓力40MPa、分離溫度40℃及分離壓力8MPa.按最佳工藝條件萃取了三份大青葉（50g）進行驗證試驗，結(jié)果靛玉紅平均含量為21.87μg/g，表明該工藝穩(wěn)定，測定值在較高范圍.

3討論

3.1萃取實驗條件的選擇在設(shè)計正交實驗時，為更準確地定位萃取溫度的水平范圍，在SFE的預(yù)實驗中做過萃取溫度最高60℃和最低30℃（其他條件固定不變）的靛玉紅回收率比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫萃取回收率較高，故在正交設(shè)計中舍去萃取溫度30℃這個水平.另三個因素的水平設(shè)定是依據(jù)儀器的工作參數(shù)而定的.在選擇夾帶劑時曾做過氯仿和甲醇的比較，因為靛玉紅在冷甲醇中易析出，故本實驗選擇氯仿為萃取夾帶劑.在預(yù)實驗中考慮了萃取時間和CO2流量的影響，結(jié)果不同的實驗條件下，分離液的流出沒有固定的時間規(guī)律，萃取儀CO2流量在2L/h左右,不可調(diào)節(jié),故未將萃取時間和CO2流量兩因素納入正交實驗設(shè)計中.

3.2HPLC條件的選擇靛玉紅在242,292,362,544nm處有吸收［2］，而本實驗中靛玉紅的紫外最大吸收波長為289nm.實驗曾用乙腈與水配比作流動相，在反相色譜中用有機堿三乙胺調(diào)節(jié)峰形，結(jié)果效果不理想.最后用甲醇比水加入醋酸銨，用酸適當(dāng)調(diào)整pH值，所得結(jié)果峰形理想，分離效果好.曾直接以氯仿作溶劑進樣，結(jié)果氯仿有較強的吸收峰，改為甲醇作溶劑后得以改善.

查閱文獻未見類似有關(guān)大青葉中靛玉紅SFE工藝的報道.而大青葉中含有的其他活性成分［3］是否被萃取出來，其含量如何，則有待進一步研究.

【參考文獻】

［1］唐俐，段積華.靛玉紅及其衍生物的研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,25(2):219-221.

［2］李彬,鄭國平.高效液相色譜法測定錫類散中靛玉紅的含量［J］.藥物鑒定,2004,13(5):39-40.

［3］陳海紅，孫建宇.大青葉的研究進展［J］.中國藥業(yè)，2004,13(8):79-80