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【論文關(guān)鍵詞】青霉素結(jié)合蛋白青霉素耐藥感受態(tài)內(nèi)酰胺類耐藥率紅霉素

【論文摘要】肺炎鏈球菌存在于人的喉部和鼻子的后部,大約40%的人平時(shí)就攜帶這種病菌,能引發(fā)肺炎、菌血癥和腦膜炎,對(duì)人類的健康構(gòu)成了一定的威脅,每年導(dǎo)致300萬(wàn)兒童死亡。更為嚴(yán)重的是,在過去用青霉素就可以殺死的肺炎鏈球菌,現(xiàn)在抵抗抗

肺炎鏈球菌存在于人的喉部和鼻子的后部，大約40%的人平時(shí)就攜帶這種病菌，能引發(fā)肺炎、菌血癥和腦膜炎，對(duì)人類的健康構(gòu)成了一定的威脅，每年導(dǎo)致300萬(wàn)兒童死亡。更為嚴(yán)重的是，在過去用青霉素就可以殺死的肺炎鏈球菌，現(xiàn)在抵抗抗生素的能力越來越強(qiáng)?？茖W(xué)家則希望通過對(duì)肺炎鏈球菌的基因測(cè)序，更好地認(rèn)識(shí)這種細(xì)菌并開發(fā)出新的抗生素。近年來肺炎鏈球菌對(duì)抗生素耐藥性呈上升趨勢(shì)，并已出現(xiàn)多重耐藥菌株，是臨床感染控制中非常棘手的難題。

1耐藥性的流行概況

在美國(guó)，上世紀(jì)80年代肺炎鏈球菌總的青霉素耐藥率不到5%，而且均為低水平耐藥（中介），到90年代初，總的青霉素耐藥率迅速上升到17%，目前已經(jīng)超過30%。Gordon等在1997年-2001年研究表明肺炎鏈球菌中耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRSP）檢出率為16.7%，對(duì)復(fù)方磺胺甲唑的耐藥率（R%）是25.0%。1997年-2000年，我國(guó)文獻(xiàn)報(bào)道的肺炎鏈球菌耐藥率（R+I）還僅在8.8%~22.5%之間，但在最近的調(diào)查中，肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的耐藥率（R+I）已高達(dá)42.7%，顯示出快速上升的勢(shì)頭。還有一些最新調(diào)查顯示，肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素的耐藥率超過了70%。目前，對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌的數(shù)量報(bào)道不一，與地區(qū)分布有關(guān)[1、2]。廣譜頭孢菌素（如頭孢曲松、頭孢氨噻）已成功用于青霉素耐藥的肺炎鏈球菌引起的嚴(yán)重感染，但對(duì)這些因子的抗藥性也似乎有所增加。肺炎鏈球菌已對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生廣泛耐藥，包括β內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類。肺炎鏈球菌對(duì)抗生素的耐藥率在逐年增長(zhǎng)，其中尤以青霉素和紅霉素最受人們關(guān)注。

2影響耐藥性的相關(guān)因素

耐青霉素G肺炎鏈球菌（PRSP）分離率近年來已在世界范圍明顯上升，特別是某些歐洲國(guó)家，美國(guó)一些地區(qū)，東南亞的某些國(guó)家地區(qū)PRSP已高達(dá)40%~50%[3、4]。肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)60年代中期，但引起人們注意的是在1977年在南非首次發(fā)生青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）引起的肺炎暴發(fā)流行[5]。以后世界各地都不斷分離出PRSP，并使其成為耐藥陽(yáng)性球菌感染中引人注目的焦點(diǎn)之一。肺炎鏈球菌的血清型與青霉素的耐藥性存在著一定關(guān)系，見表1。PRSP分離率上升與β內(nèi)酰胺類抗生素如頭孢菌素、非β內(nèi)酰胺類抗生素如大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素大量使用及某些治療方案不合理有很大關(guān)系。非β內(nèi)酰胺類抗生素大環(huán)內(nèi)酯類在臨床上治療呼吸道感染用得非常廣泛，對(duì)誘導(dǎo)肺炎鏈球菌的耐藥性也起著很大作用。如臺(tái)灣省[6]用大環(huán)內(nèi)酯類作為治療呼吸道感染的一線藥物導(dǎo)致所分離的PRSP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率高達(dá)98%。

3耐藥性的發(fā)生機(jī)制

肺炎鏈球菌對(duì)青霉素與其他β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制主要是青霉素結(jié)合蛋白PBPS的改變。肺炎鏈球菌有6個(gè)PBPS，分子量43~100kDa，PBP-la與PBP-lb分子量均為100kDa，PBP-2a（89.4kDa），PBP-2x（82kDa），PBP-2b（78kDa），PBP-3（43kDa）。敏感肺炎鏈球菌的PBP-la/lb、PBP-2a/2x/2b都很容易被β內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合而殺菌。肺炎鏈球菌耐藥株P(guān)BP-la，2x，2a與2b這4個(gè)分子量較大的PBPS則與青霉素的親和力明顯降低。編碼表達(dá)這幾個(gè)PBP蛋白的基因?yàn)閜bpla，pbp2x和pbp2b，這些耐藥基因可在同種肺炎鏈球菌之間轉(zhuǎn)移，橫向轉(zhuǎn)移，如由肺炎鏈球菌把耐藥基因轉(zhuǎn)移至草綠色鏈球菌，則pbp2b基因起著重要的作用。pbpla，pbp2x這兩個(gè)基因都在體外一步法證明可把肺炎鏈球菌對(duì)超廣譜頭孢霉素的耐藥性轉(zhuǎn)移到敏感菌株中去。肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥的作用過程包含了PBPS蛋白一系列變異。在一些青霉素耐藥的菌株中的PBPS的結(jié)構(gòu)有所改變，與β內(nèi)酰胺類抗生素的親和性降低，從而降低了對(duì)抗生素的敏感性。另外研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌PBPS基因突變，可引起相對(duì)低水平耐藥（在腦膜炎的治療中可采用大劑量治療）。人們發(fā)現(xiàn)β內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)肺炎鏈球菌的作用有兩種方式：一種是以哌拉西林為代表的裂菌式；另一種是以頭孢氨噻為代表的作用方式，這些頭孢菌素類抗生素殺菌并不溶菌，這表明β內(nèi)酰胺類抗生素作用于肺炎鏈球菌存在一些非PBPS相關(guān)的作用機(jī)制。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些非PBPS的耐藥相關(guān)基因，但并不清楚它們的作用機(jī)制。值得注意的是，這些與非PBPS基因相關(guān)的肺炎鏈球菌耐藥菌株都是感受態(tài)缺陷菌株，提示細(xì)菌的感受態(tài)可能與非PBPS途徑的耐藥機(jī)制相關(guān)。感受態(tài)是肺炎鏈球菌在其生長(zhǎng)的某一階段自然形成的一種狀態(tài)[7]，它可以攝取周圍裸露的DN段。這類似人們熟悉的在實(shí)驗(yàn)室制備大腸桿菌的感受態(tài)，不同的是大腸桿菌不能自然形成此狀態(tài)。肺炎鏈球菌的感受態(tài)是由一個(gè)叫作感受態(tài)刺激因子的17肽誘導(dǎo)形成的。最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)非PBPS的耐藥基因是ciaH，為一種組氨酸蛋白激酶。人們發(fā)現(xiàn)在頭孢噻肟耐藥的肺炎鏈球菌中，有3株感受態(tài)缺陷菌株的PBPS沒有異常改變，而發(fā)現(xiàn)ciaH的基因有變化。轉(zhuǎn)化變異的ciaH到抗生素敏感的肺炎鏈球菌中，轉(zhuǎn)化細(xì)菌同樣程度耐藥，提示細(xì)菌的耐藥與ciaH的變異相關(guān)。另一研究則發(fā)現(xiàn)在哌拉西林耐藥菌株中存在另一個(gè)基因cpoA的變化，這些菌株同樣是感受態(tài)缺陷菌株。研究發(fā)現(xiàn)，與ciaH不同，cpoA的變異體仍有一定的感受態(tài)誘導(dǎo)活性，只是在較晚的時(shí)候發(fā)生。與非PBPS相關(guān)變異的耐藥基因都與細(xì)菌的感受態(tài)相關(guān)，這提示肺炎鏈球菌的感受態(tài)可能影響了它們的表達(dá)，但目前的研究都只限于已發(fā)現(xiàn)的兩種基因ciaH和cpoA對(duì)細(xì)菌感受態(tài)的影響，并沒有研究感受態(tài)是否影響它們的表達(dá)。對(duì)頭孢氨噻和哌拉西林的最低抑菌濃度監(jiān)測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生菌株與其感受態(tài)缺陷菌株的MIC值的確有差異。提示感受態(tài)缺陷可影響菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，但對(duì)不同菌株的影響結(jié)果卻不盡相同。目前所知的非PBPS類耐藥基因只有ciaH和cpoA基因，而它們都與感受態(tài)相關(guān)。研究認(rèn)為ciaH系統(tǒng)控制了細(xì)菌脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的水平，因而該系統(tǒng)對(duì)胞壁質(zhì)的合成有一定的調(diào)控作用。一些學(xué)者認(rèn)為ciaH變異可能導(dǎo)致自身的異常激活，從而刺激細(xì)菌萜醇的合成，使脂質(zhì)聯(lián)結(jié)的胞壁質(zhì)前體水平升高，增加了胞壁質(zhì)的合成。而β內(nèi)酰胺類抗生素可能誘導(dǎo)變異的ciaH活化，產(chǎn)生上述反應(yīng)，以抵消細(xì)胞壁的損傷，使細(xì)菌表現(xiàn)出耐藥性增高。

美國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，在1994年到1999年間，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的肺炎球菌增加了3倍。為了確定肺炎球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的機(jī)制，研究人員在亞特蘭大對(duì)4148個(gè)肺炎球菌的分離株進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)6年的血清定型和藥敏試驗(yàn)。他們指出大環(huán)內(nèi)酯耐藥菌株的比例從1994年的16%增加到1999年的32%。研究人員發(fā)現(xiàn)，99%的大環(huán)內(nèi)酯耐藥菌株存在mefE或核糖體甲基化酶基因ermAM。在6年的監(jiān)測(cè)中，ermAM血清型在細(xì)菌分離株出現(xiàn)率比較穩(wěn)定，而mefE的出現(xiàn)率從1994年的9%增加到1999年的26%。到1999年，紅霉素對(duì)93%帶有mefE基因離株的最大抑制濃度增大到8mg/ml。近年來的研究表明，肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的機(jī)制涉及到多個(gè)方面，靶位改變由耐藥基因erm變?yōu)閙ls型耐藥。根據(jù)表達(dá)方式的不同，又分為cMLS內(nèi)在型耐藥和iMLS誘導(dǎo)型耐藥。在肺炎鏈球菌中的elm基因絕大多數(shù)為ermB基因，少數(shù)由ermTR基因介導(dǎo)。我國(guó)以ermB基因介導(dǎo)的內(nèi)在型耐藥為主，對(duì)紅霉素的耐藥水平較高，對(duì)林可霉素類和鏈陽(yáng)菌素B呈交叉耐藥。我國(guó)有研究顯示，148株紅霉素耐藥株中，耐藥基因以ermB基因（79.1%）介導(dǎo)為主；耐藥表型以MLS型耐藥（89.2%）為主，其中cMLS占85.1%，iMLS占4.1%，為檢測(cè)到ermTR基因。ermB基因被轉(zhuǎn)座子攜帶，例如Tn917和Tn1545。在對(duì)日本人84株肺炎鏈球菌的研究顯示出對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥與Tn917或Tn1545攜帶的erm基因有關(guān)。大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株被分成以下2組：第1組（19株）顯示對(duì)紅霉素有高度耐藥性，但是對(duì)羅奇達(dá)敏感，是由于Tn1545上ermB基因的存在。第2組（65株）顯示對(duì)這兩種抗生素均有高度耐藥性，也是由于Tn917上ermB基因的存在。2組中沒有一株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類持續(xù)耐藥，第2組中菌株的ermB基因促進(jìn)區(qū)都有一個(gè)缺失并且在主要肽鍵上還有TAAA插入子。脈沖凝膠電泳和血清學(xué)分型顯示Tn1545是克隆擴(kuò)散而Tn917是水平性克隆性擴(kuò)散，得出的結(jié)論是，日本肺炎鏈球菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株主要是ermB基因被Tn917攜帶擴(kuò)散。

在許多歐洲國(guó)家，肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥水平已經(jīng)超過對(duì)青霉素G的耐藥水平。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的廣泛應(yīng)用可能是紅霉素耐藥增加的主要原因，回顧過去19年大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用和肺炎鏈球菌的耐藥情況顯示：紅霉素的耐藥與大環(huán)內(nèi)酯類藥物的消耗有很高的相關(guān)性，而紅霉素的不同耐藥機(jī)制與不同類型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的應(yīng)用并無關(guān)聯(lián)。其不同耐藥機(jī)制的地區(qū)差異是否與多藥耐藥株的克隆傳播有關(guān)，需進(jìn)一步研究。還有學(xué)者報(bào)道，攜帶ermB基因的肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素的MIC值多大于32μg/ml，而攜帶mefA基因的肺炎鏈球菌MIC值多小于32μg/ml。根據(jù)不同耐藥與紅霉素耐藥高低的關(guān)系，有學(xué)者提出，克拉霉素、阿奇霉素因其特殊的藥代動(dòng)力學(xué)，在組織和感染部位的濃度較高，故治療攜帶mefA基因的耐紅霉素肺炎鏈球菌應(yīng)有效，但目前尚無動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)證實(shí)，仍需進(jìn)一步研究。

肺炎鏈球菌對(duì)頭孢菌素耐藥的機(jī)制為：肺炎鏈球菌與其他耐藥菌（如草綠色鏈球菌和其他肺炎鏈球菌）的脫氧核糖核酸結(jié)合后導(dǎo)致西林結(jié)合蛋白編碼的基因改變，產(chǎn)生的西林結(jié)合蛋白可減弱肺炎鏈球菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的親和力耐藥。從臨床標(biāo)本中分離出的92株肺炎鏈球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果青霉素耐藥株占25%，頭孢菌素、四環(huán)素和氯霉素隨青霉素的MIC升高而對(duì)肺炎鏈球菌的敏感性下降。青霉素敏感株的6%、中度耐藥株的57%和高度耐藥株的100%對(duì)1種以上的其他抗生素耐藥。全部菌株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感。12株多種抗生素耐藥者均對(duì)青霉素中度以上耐藥。所以萬(wàn)古霉素是治療青霉素耐藥肺炎鏈球菌感染的首選抗生素。另外，在肺炎鏈球菌對(duì)喹諾酮類耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，在分離的81株左旋氧氟沙星耐藥株中78株（96.3%）經(jīng)分析有多數(shù)喹啉耐藥決定區(qū)gyrA、gyrB、parC和pare基因突變。對(duì)喹諾酮類的耐藥機(jī)制為：DNA回旋酶變異和藥物排出。前者由gyrA、gyrB、parC和pare基因介導(dǎo)，后者由pmrA基因介導(dǎo)。根據(jù)大批量流行病學(xué)調(diào)查研究，應(yīng)用分子技術(shù)顯示鏈球菌抗生素耐藥性擴(kuò)散是克隆性擴(kuò)散。

我國(guó)的研究還發(fā)現(xiàn)，無論是兒童還是成年人分離的肺炎鏈球菌，對(duì)青霉素、紅霉素耐藥均呈迅速上升趨勢(shì)，通過對(duì)新生兒呼吸道的20株對(duì)青霉素耐藥的肺炎鏈球菌與青霉素耐藥相關(guān)的青霉素結(jié)合蛋白2編碼序列pbp2B基因，與紅霉素耐藥相關(guān)erm，mefA基因進(jìn)行了檢測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)20株新生兒臨床分離的肺炎鏈球菌苯唑西林表型耐藥率達(dá)100%，均有pbp2B基因突變。獲得erm基因的細(xì)菌可同時(shí)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素-鏈陽(yáng)菌素B耐藥，細(xì)菌也可因獲得mef基因表達(dá)主動(dòng)外排轉(zhuǎn)運(yùn)使紅霉素從細(xì)菌內(nèi)向外排出而耐藥，此機(jī)制僅耐紅霉素。20株耐青霉素的肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素的耐藥率達(dá)85%，均檢出mefA/B，17株檢出mefA基因。這項(xiàng)研究提示一線藥物已不能完全控制該地區(qū)的肺炎鏈球菌感染。

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