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【摘要】目的為女貞子藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。方法以固相萃?。⊿PE）進(jìn)行樣品供試液的前處理，采用RPHPLC法，分別測定齊墩果酸與熊果酸的含量，色譜柱：KromasilKR1005C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相：［乙腈甲醇（體積比1∶1）水（體積比90∶10）］；流速：0.8mL/min；檢測波長：210nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量：2μL。結(jié)果樣品中齊墩果酸與熊果酸得到較好的分離；齊墩果酸在0.108～3.24μg的范圍內(nèi)、熊果酸在0.060～1.800μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均回收率分別為100.50％、98.05％；11批次樣品中齊墩果酸的含量為0.639～1.340mg/g，熊果酸的含量為0.168～0.377mg/g。結(jié)論采用SPE進(jìn)行供試品溶液前處理，能夠有效消除女貞子藥材中雜質(zhì)成分對末段吸收波長的干擾，所建立的方法具有簡便、穩(wěn)定、可重復(fù)的特點，可用于女貞子藥材的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】女貞子；齊墩果酸；熊果酸；含量測定；固相萃??；HPLC

DeterminationofoleanolicacidandursolicacidinFructusligutriclucidibyRPHPLC

JIANGTiejun

(GuangzhouCheLiJiPharmaceuticalFactory,Guangzhou510290,China)

Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentsofoleanolicacidandursolicacidinFructusligustriclucidiforthequalitycontrolofFructusligustriclucidi.MethodsandResultsOleanolicacidandursolicacidwereseparatedcompletelyunderselectedchoromatographycondition.Thecontentrangeofoleanolicacidinelevenbatchesofsampleswas6.39-13.40（mg/g）,andthecontentrangeofursolicacidwas1.68-3.77（mg/g）.ConclusionThismethodissimple,stable,accurateandreliableforthequalitycontrolofFructusligutriclucidi.

Keywords:Fructusligutriclucidi;oleanolicacid;ursolicacid;HPLC

女貞子為常用中藥，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等證［1］724。女貞子中主要含有三萜類成分，其中齊墩果酸為主要的代表性成分，此外尚含有熊果酸等。有關(guān)女貞子藥材及含女貞子中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量多以齊墩果酸的含量作為評價指標(biāo)［1］728。中國藥典2005年版（一部）［3］收載女貞子的含量測定方法為薄層掃描法測定齊墩果酸的含量。近年來，亦有文獻(xiàn)采用HPLCUV方法［4］以及HPLCELSD方法［5］測定本品中兩成分的含量，但由于HPLCUV測定波長在末端吸收，不能有效排除供試品中的雜質(zhì)對測定結(jié)果準(zhǔn)確度的影響；而ELSD檢測器還未能普遍應(yīng)用。因此上述方法都有一定的局限性。

固相萃?。⊿PE）是一種新興的樣品前處理技術(shù)，近年來已經(jīng)應(yīng)用于中藥含量測定方法研究［6-8］，但還未見有將此方法應(yīng)用于女貞子的含量測定中。本文報道采用此技術(shù)進(jìn)行女貞子藥材樣品的前處理，結(jié)合反相高效液相色譜法，消除了樣品中雜質(zhì)對齊墩果酸、熊果酸在紫外末端測定的干擾，使樣品中齊墩果酸與熊果酸在同一色譜條件下較好地得到了分離，并進(jìn)行了多批次樣品的含量比較，以期為女貞子藥材的質(zhì)量評價提供更穩(wěn)定可靠的方法。

1儀器與試藥

HP1100Series高效液相色譜儀（美國Agilent），二極管陣列檢測器及HPChemStation4.0色譜工作站；Millipore純凈水發(fā)生器（MilliporeCo.Ltd.,USA）；SUPELCLEAN固相萃取小柱（500mg/3mL，美國SUPELCO公司）。

齊墩果酸（oleanolicacid）、熊果酸（urosolicacid）對照品及女貞子對照藥材（批號1041－9701）購自中國藥品生物制品檢定所，女貞子藥材測試品來源見表1。液相色譜純試劑為Merck公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1女貞子藥材樣品來源（略）

Tab.1SamplesofFructusligutriclucidi

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性

以KromasilKR1005C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱；以［乙腈甲醇（體積比1∶1）水（體積比90∶10）］為流動相；流速為0.8mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為210nm；進(jìn)樣量為5μL。理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計算應(yīng)不低于5000，按熊果酸峰計算應(yīng)不低于4000，二者的分離度為1.47，齊墩果酸的拖尾因子為1.02，熊果酸的拖尾因子為0.99。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1對照品（A）及女貞子藥材（B）HPLC色譜圖（略）

Fig.1HPLCchromatogramsofreferencesubstances（A）andsampleofFructusligutriclucidi

2.2對照品溶液制備

精密稱取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度為216μg/mL，120μg/mL的溶液，備用。精密吸取上述對照品溶液各1mL，置2mL量瓶中，充分混和，制成對照品混合溶液，備用。

2.3線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述對照品混合溶液1、2、4、6、8、10、20、30μL，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（A）對照品質(zhì)量（m）進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：齊墩果酸A=0.5954m+6.0525，r=0.9999，線性范圍0.108～3.24μg；熊果酸A=0.7213m+2.7388，r=0.9999，線性范圍：0.060～1.800μg。

2.4供試品溶液制備

取女貞子藥材粉末約1.0g，精密稱定，加三氯甲烷20mL，稱重，水浴回流提取2次，每次0.5h，冷卻后稱重，加溶劑補(bǔ)足重量，濾過，合并濾液，水浴蒸干溶劑，殘渣以三氯甲烷5mL溶解，加于固相萃取小柱上，收集洗脫液于10mL量瓶中，繼續(xù)加4mL洗脫，合并至量瓶中，加三氯甲烷至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.5穩(wěn)定性試驗

精密吸取對照品混合溶液5μL，分別于0、1、2、4、8、12、24h測定，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積分別為776.4、248.5，RSD分別為1.22％、1.43％。

2.6精密度試驗

精密吸取對照品混合溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積分別為767.9、246.4，RSD分別為0.72％、1.09％。

2.7重復(fù)性試驗

取同一批次供試品9份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，吸取2μL進(jìn)樣，進(jìn)行測定，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.93％（n=9）、0.25％（n=9），RSD分別為1.51％、2.56％。

2.8回收率試驗

取6份同一已知齊墩果酸和熊果酸含量的女貞子藥材0.5g,精密稱定，分別準(zhǔn)確加入齊墩果酸、熊果酸對照品各適量，余同“2.4”項下操作，進(jìn)樣2μL，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果齊墩果酸、熊果酸的平均回收率及RSD分別為100.50%、98.05%和2.36%、2.6%，見表2、3。

2.9樣品含量測定

取11批樣品各1g，依法制成供試品溶液，精密吸取2μL，依選定的色譜條件進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表2齊墩果酸加樣回收率試驗（略）

Tab.2Recoveryresultsofoleanolicacid

表3熊果酸加樣回收率試驗（略）

Tab.3Recoveryresultsofursolicacid

表4女貞子藥材齊墩果酸、熊果酸含量測定結(jié)果（略）

Tab.4Determinationresultsofoleanolicacidandursolicacid

3討論

3.1三萜類成分為女貞子中的主要成分，齊墩果酸為其中的代表性成分。本文采用硅膠作為固相萃取的填料，能夠有效吸附女貞子提取液中的雜質(zhì)，從而保證了樣品在210nm下受到的干擾最小。

3.2供試品制備過程中，SPE小柱洗脫后收集三氯甲烷溶液蒸干，殘渣若用甲醇溶解，結(jié)果殘渣不能完全溶解，可能是由于三氯甲烷洗脫液中包含有少量不溶于甲醇的非極性物質(zhì)；而且齊墩果酸、熊果酸含量比本文采用的樣品處理方法的含量低約11%。而對照品加甲醇，則能夠完全溶解。表明樣品中的非極性雜質(zhì)在用甲醇溶解時，由于其不溶于甲醇而包裹了部分齊墩果酸、熊果酸從而導(dǎo)致含量降低。另外，若用甲醇洗脫，由于甲醇的洗脫能力太強(qiáng)，將雜質(zhì)一并洗脫，不能使SPE起到凈化樣品的作用。采用三氯甲烷洗脫既能有效洗脫齊墩果酸、熊果酸，又能減少雜質(zhì)的干擾，因此最終決定采用三氯甲烷作為樣品溶劑。

3.3SPE小柱有100mg/3mL、500mg/3mL等不同的規(guī)格，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)100mg/3mL小柱不能完全吸附齊墩果酸和熊果酸，導(dǎo)致回收率偏低。而500mg/3mL則能夠完全吸附。因此，在采用SPE方法進(jìn)行樣品前處理時，應(yīng)考慮SPE小柱的吸附容量大小對含量測定的影響。

3.4從測定的11批結(jié)果看，不同來源的女貞子藥材中齊墩果酸差異為2.1倍；熊果酸的差異為2.2倍。表明不同來源的女貞子藥材中二者的含量有一定的差異。

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