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本文作者：程春松1，2彭代銀1黃和平1郭友平1作者單位：1安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

基本檢測技術(shù)的應(yīng)用

現(xiàn)代生物檢測技術(shù)在藥用植物的基源鑒定研究、轉(zhuǎn)基因育種等各方面都有著廣泛的應(yīng)用，在菘藍(lán)的育種研究PCR及RT－PCR技術(shù)、SouthernBlot分析、RAPD技術(shù)在外源基因檢測、抗性基因的檢測中取得了良好的效果。

1PCR及RT－PCR技術(shù)：1985年，KaryMul－lis發(fā)明了PCR技術(shù)，引用到藥用植物育種研究中，可以通過分離植物基因來鑒定中藥中的目的基因以及DNA指紋圖譜研究。許鐵峰等［11］為了驗(yàn)證外源基因是否轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)，對抗生素抗性植株進(jìn)行了PCR檢測，對轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源半夏凝集素基因進(jìn)行RT－PCR分析，由于PCR只能證明在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)存在外源目的基因片段，而不能完全確定外源目的基因片段已整合進(jìn)植物基因組，且PCR可能存在假陽性結(jié)果，因此通常配合采用SouthernBlot分析驗(yàn)證。

2RAPD與擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性技術(shù)：1990年代提出RAPD技術(shù)，該技術(shù)現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于生物的品種鑒定、系譜分析及進(jìn)化關(guān)系的研究［16］。陳桂平等［12］選取同一個(gè)無性系植株及其親本進(jìn)行RAPD分析，得出結(jié)果無性系植株的遺傳背景一致性很好，但也發(fā)生了DNA水平的變異。這項(xiàng)工作為進(jìn)一步分離抗性基因和培育抗病品種打下基礎(chǔ)。相對于RAPD技術(shù)，AFLP技術(shù)與之相類似，它是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，能檢測10倍的軌跡，并且可以檢測任何DNA。

染色體研究技術(shù)的應(yīng)用

藥用植物染色體研究是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，主要是包括總DNA的提取、染色體制片技術(shù)、核型研究以及其結(jié)構(gòu)分析。

1菘藍(lán)總DNA的提取：核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗，所得的DNA應(yīng)達(dá)到滿足試驗(yàn)要求的量和純度。陳桂平等［12］運(yùn)用的菘藍(lán)總DNA提取方法是采用改良的十二烷基磺酸鈉微量提取法提取DNA。丁如賢等［10］采用改良十六烷基三甲基溴化胺法提取總DNA。CTAB是陽離子去污劑，可以很好地去除多糖，因此對于植物DNA的提取具有較高的廣譜性，而SDS是陰離子去污劑，對多糖含量高的植物樣品效果比較差。

2染色體制片技術(shù)：菘藍(lán)染色體很小，因此，在測量長臂和短臂時(shí)，難以確定長、短臂的分界線，只有制作染色體分散、染色體分開，而著絲粒未分開的染色體標(biāo)本，并把染色體相片盡量放大，才能較準(zhǔn)確地確定著絲點(diǎn)的位置，使數(shù)據(jù)可靠［17］。楊飛等［18］在大麥、玉米染色體研究中多采用去壁低滲火焰干燥壓片法，該方法簡單易行，適合植物染色體制片。

3核型研究：核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型，是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。核型研究就是在對染色體進(jìn)行測量計(jì)算的基礎(chǔ)上，進(jìn)行分組、排隊(duì)、配對，并進(jìn)行形態(tài)分析的過程。楊飛等的報(bào)道［18］表明：菘藍(lán)的核型公式為2n＝2x＝14＝10m（2SAT）＋4sm，菘藍(lán)核型的對稱等級為2A，是一種比較對稱的核型。鹿萍［17］報(bào)道二倍體染色體數(shù)為14條，核型公式為2n＝2x＝14＝14m，四倍體染色體數(shù)為28條，核型公式為4n＝4x＝28＝28m。以上研究基本確定了菘藍(lán)染色體的數(shù)目、大小及形態(tài)特征。

4染色體分析：隨著分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，熒光原位雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于染色體識別和分析［19］。45SrDNA和5SrDNA是編碼核糖體rRNA的基因，參與構(gòu)建核糖體，已被作為十字花科核型進(jìn)化分析及比較基因組學(xué)研究的重要細(xì)胞學(xué)標(biāo)記［20］。楊飛等［18］為了深入研究菘藍(lán)的分子細(xì)胞學(xué)特征，以45SrDNA、5SrDNA和端粒序列為探針，對菘藍(lán)有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，建立菘藍(lán)熒光染色體核型。為菘藍(lán)分子細(xì)胞遺傳圖譜的構(gòu)建提供了必要依據(jù)。

組織培養(yǎng)技術(shù)

組織培養(yǎng)技術(shù)是藥用植物育種過程中一項(xiàng)基本技術(shù)。客紹英等［21］以菘藍(lán)幼葉為外植體，對其誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中細(xì)胞啟動、脫分化、組織分化和器官（芽和根）發(fā)生，進(jìn)行了石蠟切片觀察和分析。李連華等［22］以菘藍(lán)愈傷組織為試驗(yàn)材料，分析比較了不同培養(yǎng)基對菘藍(lán)愈傷組織增殖和分化的影響。此外張勝珍等［23］用纖維素酶和離析酶的混合酶液提取菘藍(lán)無菌苗幼葉原生質(zhì)體，他們探索了菘藍(lán)原生質(zhì)體分離和純化的條件，為菘藍(lán)的細(xì)胞工程育種做出了有效的探索。