種質研究論文：RAPD在種質研究的運用
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本文作者：于華平1程曉建1房經貴2宋長年2作者單位：1浙江廣播電視大學2南京農業(yè)大學
1在種質資源起源上的應用
我國是果樹的起源中心(多樣化中心或基因中心)之一。許多樹種栽培歷史久遠，種質資源極為豐富，經過自然雜交，種質相互滲透，種屬間進化上具有很大的同源性。利用RAPD標記可獲得物種間DNA水平的多態(tài)性資料，了解其主要遺傳物質DNA之間的同源程度，從而確定親緣關系和進化地位。Omura等［12］通過RAPD分析發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑與日本立花橘間的相似系數(shù)較小，而與我國浙江黃巖本地早的相似系數(shù)較大，從而進一步確認了溫州蜜柑起源于中國的觀點;吉前華等［13］利用RAPD技術研究了地方優(yōu)良品種貢柑與部分柑橘屬植物之間的親緣關系，也對貢柑的起源進行了初步的探討，支持貢柑是由本地橘和橙的自然雜交而來的觀點，并偏向橘遺傳基礎。親本的確立可以為育種者選配育種親本提供有用的信息。由于許多果樹栽培品種最初從實生苗而來，父母本不清，RAPD標記為親本的確立提供了一種有效手段。Harada等［14］根據(jù)RAPD分析結果認為，喬納金(金冠×紅玉)和陸奧(金冠×印度)2個三倍體蘋果品種其減數(shù)分裂的2n配子是由金冠提供的，這一結果與以前的同工酶分析結果一致。津輕蘋果的父本因當時記載不詳一直不得而知，結合RFLP和RAPD分析結果確認其父本為紅玉。程中平［15］利用RAPD分子標記技術并結合前人在形態(tài)學、細胞學、孢粉學和酶學的研究結果，認為桃、李、杏、梅、櫻類植物可劃分為桃屬、李屬、杏屬和櫻屬，其中桃屬是最進化的類型，這與俞德浚將大李屬細劃為4個小屬的觀點一致［16］。這些研究充分說明了RAPD技術作為一種分子鑒定的有力工具，已經成為了傳統(tǒng)形態(tài)學，細胞學和同功酶分析鑒定物種的有力補充。
2在種質資源的遺傳多樣性和親緣關系上的分析
遺傳多樣性是物種適應自然和進化的基本特征，它源于核酸序列不同和基因突變。天然植物群體的遺傳多樣性程度受遺傳漂變、遷移、突變和選擇等綜合因素的影響，其基因頻率會在一定的水平上波動，反映在核酸水平上就會呈現(xiàn)出特定DN段的多態(tài)性。因此，利用RAPD技術對遺傳多樣性進行快速檢測，可以避免受環(huán)境、組織特異性和發(fā)育階段的影響。冷翔鵬等［17］利用RAPD和SSR2種標記分別對系譜關系明確的22個巨峰系葡萄品種進行聚類分析，以驗證2種標記方法的正確性與可靠性。結果顯示，2種分子標記聚類結果基本一致，均適合于巨峰系葡萄的系譜分析和種質遺傳多樣性研究;Luro等［18］應用RAPD技術證明了寬皮柑橘品種間高度的遺傳多樣性，說明在寬皮柑橘品種的演化中起主要作用的是有性雜交和性狀重組;在桃的遺傳多樣性研究方面，程中平等［19］用RAPD標記技術對203份桃屬材料進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)砧木類遺傳多樣性指數(shù)最高，紅葉桃、蜜桃、蟠桃和黃肉桃次之，壽星桃、碧桃、垂枝桃、硬肉桃和水蜜桃最低;譚曉風等［20］對香榧8個主要栽培種用RAPD進行分析，聚類結果與傳統(tǒng)形態(tài)學的2大類基本吻合;為了探討梅的2種類型———花梅與果梅的遺傳多樣性，王玉娟等［21］利用改良的RAPD技術對25個花梅和21個果梅品種的基因組總DNA進行了分析，并在此基礎上采用UPGMA聚類方法對花梅與果梅品種間的遺傳關系進行了分析。結果顯示:花梅和果梅各品種間具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結果顯示花梅和果梅具有相近的親緣關系，遺傳背景相似。
3種質資源的鑒定
1）品種鑒定和指紋圖譜繪制
果樹大多是多年生木本植物，且主要采用無性繁殖。長期以來，不同地域相互引種栽培致使出現(xiàn)了許多同物異名和同名異物現(xiàn)象，品種名和品種分類十分混亂。對現(xiàn)有果樹品種準確地鑒定和分析，是進一步科學有效地利用果樹資源的基礎。過去進行品種分類和鑒定主要采用比較形態(tài)學并結合細胞學、孢粉學和酶學等方法，這些方法對關系較近的材料不能準確區(qū)分。近10多年來，發(fā)展起來的分子標記技術為品種鑒定開辟了新的技術手段。吉前華等［22］利用梯度PCR優(yōu)化了RAPD反應條件，建立了RAPD-PCR分析的最佳反應體系，顯著提高了柑橘RAPD分析的特異性、效率和穩(wěn)定性。結果證明，RAPD分析是品種純度鑒定研究的簡單實用的方法。潘新法等［23］運用RAPD分析技術，對16個枇杷品種的基因組DNA進行RAPD分析，表明不同枇杷品種基因型間存在著極為豐富的遺傳多樣性，擴增的DNA指紋圖譜可將16個品種一一區(qū)分，為枇杷品種鑒定提供新的方法，同時也為分子標記輔助育種提供了依據(jù);喬玉山等［24］以奉化李為試材，對中國李RAPD反應體系進行了優(yōu)化，利用該優(yōu)化反應體系，用10個隨機引物，構建了5個中國李品種的RAPD指紋圖譜，并以共有譜帶率對這些品種遺傳關系進行了分析;Harada等［25］用1個RAPD引物區(qū)分出了38個蘋果品種。此外，在香蕉、龍眼、梨、柿、等作物上也開展了這方面的研究工作。
2）突變鑒定
果樹在長期的無性繁殖過程中，形成了形形色色的突變類型，通過分子標記也可以發(fā)現(xiàn)眾多突變類型，多數(shù)芽變是源于原有品種的微小變化，采用形態(tài)學、同工酶分析難以鑒定，借助分子標記在一定程度上可提高芽變鑒定的成功率。對于不同的果樹芽變類型，RAPD標記技術表現(xiàn)出不同的鑒定可行性。房經貴等［26］對RAPD標記應用于果樹芽變鑒定中的可行性進行了探討;金勇豐等［27］用RAPD標記分析桃品種布目早生和其早熟芽變大觀1號基因組DNA多態(tài)性，篩選出1個引物可檢測出兩者間的多態(tài)性;Kaemmer等［28］與Yang等［29］利用RAPD分別成功地鑒別出香蕉和甜櫻桃的芽變系。RAPD標記在其他突變體的鑒別上也有應用。如張開春［30］曾采用RAPD標記將蘋果品種紅星和其短枝型突變體新紅星等區(qū)別開;Sagawara等［31］還鑒定了幾個柑橘嵌合體;劉成明等［32］對荔枝懷枝和三月紅及其焦核芽變進行了RAPD分析，分別獲得了OPL-121645和OPL-127222個特異性片段，初步認為這2個片段與焦核性狀有關。
3）體細胞雜種的鑒定
現(xiàn)代栽培作物的遺傳基礎狹窄是作物改良的一個主要障礙，通過遠緣雜交、體細胞雜交等方法導入外源遺傳物質，是擴大遺傳多樣性的主要途徑。史永忠等［33］通過優(yōu)化條件，建立起柑橘RAPD分析體系并成功地應用于體細胞雜種的鑒定;肖順元等［34］采用RAPD分析準確無誤地鑒別了Volbaner檸檬與酸橙的體細胞雜種;Sawazaki等［35］應用RAPD鑒定出了歐洲葡萄與圓葉葡萄雜種。
4）種質保存和核心種質的建立
RAPD技術可以為種質資源的研究提供幾乎無限的多態(tài)性證據(jù)。通過進行資源鑒別，可以避免在資源保存中經常發(fā)生的重復、混淆，為種質資源保存提供科學的依據(jù)。
存在問題及展望
對RAPD的穩(wěn)定性和重復性差的缺陷，許多研究者通過優(yōu)化反應條件，嚴格控制反應程序中各個環(huán)節(jié)參數(shù)，選用適合品種的引物等多種措施改善和提高。在今后的研究中仍需對RAPD技術進行改進，使其成為更簡便、準確、有效、安全、廉價的檢測手段。盡管RAPD技術在我國果樹研究中應用還較有限，主要用在物種進化、品種分類、雜種鑒定等方面，但是已有許多果樹構建了分子圖譜與目的基因緊密連鎖的穩(wěn)定的標記正在不斷地挖掘，可以預見隨著分子生物學的發(fā)展RAPD技術在不斷完善的同時，也必將在果樹研究中發(fā)揮越來越大的作用。
