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本文作者：劉國琴1，2鄭鵬華1滕元文1作者單位：1浙江大學(xué)園藝系2貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院

水分代謝相關(guān)基因

果樹體內(nèi)水分的轉(zhuǎn)運(yùn)和存在狀態(tài)對(duì)果樹芽休眠產(chǎn)生明顯影響，休眠的誘導(dǎo)和解除過程中伴隨著束縛水和自由水之間的相互轉(zhuǎn)換[41-42]。在梅[17]、桃[37]、歐洲葡萄[43]等植物中均發(fā)現(xiàn)脫水蛋白基因，可能與休眠有關(guān)。脫水素是LEA蛋白的一種，在低溫和脫水脅迫時(shí)誘導(dǎo)合成，具有較高的親水性，可能起到束縛水的作用[44]。Pacey-Miller等[43]發(fā)現(xiàn)葡萄在萌芽的過程中，脫水素總體呈下降趨勢，但在芽膨大前有2個(gè)小高峰。Yamane等[17]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)不同需冷量梅品種而言，花芽脫水素基因的表達(dá)量不同，高需冷量品種‘Nanko’比低需冷量品種‘Ellching’的表達(dá)量高。水通道蛋白又名水孔蛋白，是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，可控制水分在細(xì)胞的進(jìn)出，從而對(duì)水分的轉(zhuǎn)運(yùn)和平衡起重要的調(diào)控作用。根據(jù)亞細(xì)胞定位，高等植物的水通道蛋白主要分為質(zhì)膜內(nèi)在蛋白和液泡膜內(nèi)在蛋白2大類，都屬于內(nèi)在蛋白家族成員。其中TIP又分為α、β、γ、δ-TIP4大類。Mazzitelli等[16]研究發(fā)現(xiàn)樹莓休眠向生長階段轉(zhuǎn)變過程中AQP下調(diào)表達(dá)。Mathiason等[45]報(bào)道在滿足葡萄需冷量期間PIP被誘導(dǎo)。Yooyongwech等[46-47]發(fā)現(xiàn)AQP基因與桃的休眠相關(guān)，并且PIP和TIP的表達(dá)模式和可能的作用不同。2個(gè)需冷量不同的品種在內(nèi)休眠解除時(shí)δTIP1和PIP2表達(dá)量上調(diào)，而γTIP1和PIP1在高需冷量品種‘KansukeHakuto’中的表達(dá)量要比低需冷量品種‘Coral’高，Yooyongwech等[47]認(rèn)為γTIP1和PIP1可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)和胞間水分的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要的調(diào)控作用，增加其抗冷性和防止冰晶的形成，而δTIP1和PIP2可能作為內(nèi)休眠解除的信號(hào)。AQP的過量表達(dá)能提高歐洲板栗芽的含水量[21]。這些都說明了AQP基因?qū)τ诠麡湓谛菝咂陂g細(xì)胞內(nèi)和胞間水分的轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要的調(diào)控作用。

能量與物質(zhì)代謝相關(guān)基因

落葉果樹芽進(jìn)入休眠后，樹體內(nèi)只進(jìn)行基本的生理生化活動(dòng)，新陳代謝弱，其中呼吸代謝的持續(xù)進(jìn)行是休眠過程的顯著特點(diǎn)，涉及到不同類型呼吸的代謝途徑、呼吸代謝物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)變[2，8，12，48]。腺苷三磷酸水解酶（ATPase）是植物生命活動(dòng)的“主宰酶”，對(duì)植物的許多生命活動(dòng)起著重要的調(diào)控作用，酶活性的改變影響膜系統(tǒng)對(duì)物質(zhì)的運(yùn)輸能力?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)休眠起著調(diào)控作用[8，12，16，43，49]。桃在休眠開始時(shí)，芽中的ATPase活性低于芽下組織（budstands），但隨著休眠的逐步加深，芽中的ATPase活性逐漸增加，并高于芽下組織，萌發(fā)時(shí)，芽和芽下組織ATPase活性達(dá)到最高峰[49]；核桃芽中的ATPase活性休眠期間沒有萌發(fā)期高[12]。在桃芽休眠階段，已分離了H+-ATPase家族4個(gè)基因成員PPA1、PPA2、PPA3和PPA4，并且發(fā)現(xiàn)這4個(gè)成員對(duì)休眠的調(diào)控作用不同，認(rèn)為該基因的調(diào)控可能參與糖類物質(zhì)的共轉(zhuǎn)運(yùn)，PPA1、PPA2、PPA3在休眠解除后的芽中上調(diào)表達(dá)，可能有利于內(nèi)休眠的解除，而PPA4則下調(diào)表達(dá)[49]。Pacey-Miller等[43]報(bào)道了葡萄休眠期能量代謝有關(guān)的基因所占的比例高達(dá)17%。Mazzitelli等[16]認(rèn)為在休眠解除時(shí)，樹莓芽分生組織需要從別的組織獲取大量的糖類物質(zhì)，來維持芽的生長，而此時(shí)H+-ATPase的基因上調(diào)表達(dá)，NAD-山梨醇脫氫酶基因下調(diào)表達(dá)。Mathiason等[45]研究發(fā)現(xiàn)在滿足需冷量的河岸葡萄越冬芽中碳水化合物代謝（32.4%）和能量代謝（18.6%）相關(guān)的基因所占的比例就高達(dá)51%。檸檬酸合成酶、ATP檸檬酸裂解酶、ATP/ADP轉(zhuǎn)運(yùn)體、磷酸烯醇式丙酮酸激酶和核酮糖1，5-二磷酸羧化酶基因等在滿足需冷量的葡萄越冬芽中下調(diào)，與碳水化合物代謝相關(guān)的編碼蔗糖合成酶、己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及異構(gòu)酶等的基因也下調(diào)表達(dá)。Mathiason等[45]提出在滿足需冷量期間芽的代謝活性和能量需求是較低的。在黑醋栗休眠過程中，發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A羧化酶基因在休眠期表達(dá)低，隨著休眠的解除，表達(dá)量逐漸升高[20]。

激素代謝相關(guān)基因

激素對(duì)果樹芽休眠調(diào)控有重要作用，不同激素對(duì)果樹芽休眠的誘導(dǎo)和解除的作用不同[2]。ABA、GA、IAA、CTK和乙烯受到不同信號(hào)（物理信號(hào)和化學(xué)信號(hào)）的調(diào)控，從而起到不同的作用，因此相關(guān)激素合成基因與信號(hào)響應(yīng)基因互作控制芽的休眠和生長。在草本植物和一些多年生木本植物上已有關(guān)于激素代謝相關(guān)基因的報(bào)道，馬鈴薯休眠芽中分離了生長素響應(yīng)因子基因ARF6[50]。牡丹上分離了生長素抑制蛋白基因和赤霉素合成酶基因GA20，發(fā)現(xiàn)ARP在牡丹休眠解除前期的表達(dá)量高，在休眠解除后表達(dá)量降低，之后又上調(diào)[51]。楊樹上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因ABI1B、ABI1D和ABI3[31]。王新超[52]對(duì)茶樹芽休眠不同階段的生長素相關(guān)基因如生長素響應(yīng)因子類基因、生長素原初反應(yīng)類基因、生長素抑制蛋白基因、生長素誘導(dǎo)基因、生長素運(yùn)輸類基因、生長素結(jié)合類基因等進(jìn)行了研究，結(jié)果初步說明生長素促進(jìn)茶樹腋芽的休眠，其中生長素響應(yīng)因子類基因和生長素原初反應(yīng)類基因與茶樹芽休眠與解除存在復(fù)雜的關(guān)系，還有待于進(jìn)一步的研究證明。Mazzitelli等[16]在樹莓上也發(fā)現(xiàn)與休眠相關(guān)的基因，生長素響應(yīng)蛋白、ABA誘導(dǎo)蛋白和赤霉素調(diào)控等基因，ABA誘導(dǎo)蛋白基因在休眠轉(zhuǎn)換期間下調(diào)。Pacey-Miller等[43]報(bào)道了歐洲葡萄休眠過程中生長素誘導(dǎo)蛋白基因的表達(dá)在芽開始膨大前2周上調(diào)，然后表達(dá)下降。Mathiason等[45]發(fā)現(xiàn)河岸葡萄越冬芽中ABA相關(guān)基因下調(diào)，而GA受體下調(diào)。

細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因

芽休眠的解除就是分生組織的重新生長，分生組織逐漸由休眠向細(xì)胞增生轉(zhuǎn)變，受細(xì)胞周期調(diào)控[10，53]，細(xì)胞周期調(diào)控主要受細(xì)胞周期蛋白（cyclin，CYC）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的調(diào)控。這些調(diào)控基因包括CYCA、CYCB、CYCD和CDKB等，均已在多種植物上克隆和分離出來，且多呈現(xiàn)出休眠期表達(dá)低，休眠解除后表達(dá)高的變化趨勢[52，54-56]。Watillon等[57]從蘋果中分離了類KN1基因，分別命名為KNAP1和KNAP2基因。Brunel等[58]研究報(bào)道KNAP2基因的表達(dá)與蘋果芽的生長潛力負(fù)相關(guān)，且KNAP2表達(dá)與芽所處的位置變化很大，枝條頂部的芽總是比枝條中部和基部的芽的表達(dá)低，而枝條中部和基部的芽在生長期間仍保持休眠。Mathiason等[45]研究發(fā)現(xiàn)在滿足需冷量的葡萄越冬芽中與細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因所占的比例達(dá)1.4%，且涉及細(xì)胞信號(hào)和細(xì)胞生長的基因被激活，與細(xì)胞分裂和生長相關(guān)的肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞壁松弛蛋白、亞精胺合成酶和植物磺肽素基因均上調(diào)，通過細(xì)胞的分裂、細(xì)胞的伸長和細(xì)胞的松弛有助于芽生長。

活性氧代謝相關(guān)基因

果樹在休眠期間活性氧代謝發(fā)生了變化，休眠期間不同的樹種活性氧種類和抗氧化酶的種類和活性不盡相同[16，43，59-60]。Pacey-Miller等[43]報(bào)道了葡萄休眠芽中活性氧代謝相關(guān)的基因Cu/Zn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶基因表達(dá)高。Mazzitelli等[16]在樹莓上也發(fā)現(xiàn)編碼抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽還原酶基因在休眠解除時(shí)表達(dá)上調(diào)。Pérez等[61]報(bào)道低溫增加葡萄過氧化物酶基因的表達(dá)。

DAM基因

MADS-box是在轉(zhuǎn)錄因子家族中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的基序，MADS-box基因是一類調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要基因，涉及到植物生長發(fā)育的許多方面，如植物花器官的發(fā)育、物質(zhì)和能量代謝、信號(hào)的傳遞和轉(zhuǎn)導(dǎo)以及休眠等過程[18，62-65]。MADS-box基因?qū)麡溲啃菝叩淖饔谜鸩奖唤沂?，在不同的果樹如桃、梨、梅和獼猴桃上克隆或分離并進(jìn)行了表達(dá)分析和功能鑒定。Bielenberg等[63]分離了與桃休眠相關(guān)的6個(gè)MADS-box基因，并把與休眠相關(guān)的MADS-box基因稱為DAM基因，分別命名為DAM1、DAM2、DAM3、DAM4、DAM5和DAM6。Li等[66]研究了桃的6個(gè)DAM基因有不同的季節(jié)和光周期表達(dá)模式，DAM3對(duì)光周期沒有反應(yīng)，可能受低溫的調(diào)控，DAM1、DAM2和DAM4在時(shí)間上與季節(jié)性的伸長停止和芽的形成有關(guān)。Jiménez等[67]在研究桃芽休眠過程時(shí)發(fā)現(xiàn)DAM3、DAM5和DAM6在冬季低溫條件下表達(dá)下調(diào)，而且在不同的品種中有相似的變化趨勢。Leida等[19]用SSH方法鑒定了與桃芽休眠解除相關(guān)的特異基因，獲得了101個(gè)特異表達(dá)的基因，其中就有DAM4、DAM5和DAM6，且發(fā)現(xiàn)DAM6在桃的2個(gè)品種上表達(dá)模式不同，品種‘Zincal5’DAM6開始下調(diào)的時(shí)間比‘Springlady’大約要提前1個(gè)月。Yamane等[68-69]報(bào)道了DAM5和DAM6基因與桃的內(nèi)休眠有關(guān)，2個(gè)基因的表達(dá)有組織特異性，在田間自然條件下，葉片，莖、側(cè)葉芽和側(cè)花芽在內(nèi)休眠期間上調(diào)表達(dá)，內(nèi)休眠解除后下調(diào)，進(jìn)行延長低溫處理研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因的表達(dá)與芽的萌芽率呈正相關(guān)的關(guān)系。Leida等[70]對(duì)桃休眠過程中DAM6基因的組蛋白修飾和表達(dá)進(jìn)行了分析，染色質(zhì)的修飾加強(qiáng)了DAM6基因的表觀遺傳調(diào)控和芽休眠的解除。Ubi等[18]從日本梨上克隆了2個(gè)與休眠相關(guān)的MADS-box基因，分別命名為PpMADS13-1和Pp-MADS13-2，并報(bào)道了該基因在2個(gè)梨品種的表達(dá)情況，在高需冷量品種‘Kosui’中2個(gè)DAM基因表現(xiàn)為相同的變化趨勢，隨著內(nèi)休眠的解除，DAM基因逐漸下調(diào)，但PpMADS13-2的表達(dá)量比Pp-MADS13-1高。而低需冷量品種‘TP-85-119’中表達(dá)量很低，幾乎檢測不到。Yamane等[71]用SSH法篩選出與梅休眠相關(guān)的MADS-box基因，命名為PmDAM6，并進(jìn)行了表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)PmDAM6在內(nèi)休眠開始時(shí)表達(dá)上調(diào)，內(nèi)休眠解除期間表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為PmDAM6可能與梅側(cè)芽內(nèi)休眠的誘導(dǎo)和解除有關(guān)，在沒有外界抑制條件如頂端優(yōu)勢和惡劣的環(huán)境條件下，即適宜芽萌發(fā)的條件下，PmDAM6可能作為內(nèi)部抑制基因起到延遲和抑制芽生長的作用，把該基因看成為調(diào)控梅側(cè)芽休眠的候選基因。Sasaki等[65]并對(duì)PmDAM6進(jìn)行了功能鑒定，過量表達(dá)PmDAM6，能抑制楊樹生長。根據(jù)梅的基因組，鑒定了6個(gè)PmDAMs，并對(duì)其進(jìn)行了季節(jié)表達(dá)分析和延長低溫處理，結(jié)果表明在內(nèi)休眠解除之前6個(gè)PmDAMs的表達(dá)量維持在低水平，而且在短期低溫處理下，PmDAM1和PmDAM6在高需冷量品種表達(dá)量有所增加，而低需冷量品種表達(dá)量降低，此外，PmDAM1和PmDAM6的表達(dá)與內(nèi)休眠的解除呈負(fù)相關(guān)。Wu等[72]從美味獼猴桃中分離了4個(gè)MADS-box基因，發(fā)現(xiàn)在根、莖、葉、花、芽和果實(shí)中的表達(dá)量不同。在越冬期間芽中的表達(dá)量積累，表明對(duì)芽的休眠起作用。在花芽分化前表達(dá)量下調(diào)，可能作為花阻遏物對(duì)花的發(fā)育發(fā)生作用。在擬南芥中進(jìn)行過量表達(dá)和蛋白互作研究發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)基因能夠與突變體互補(bǔ)，表明獼猴桃的這些基因在芽休眠和開花過程中發(fā)揮不同的作用?？傊?，這些研究結(jié)果表明DAM基因?qū)β淙~果樹芽休眠起著重要的調(diào)控作用，DAM基因可能是芽休眠因素中最有希望的關(guān)鍵因子。今后關(guān)于證明DAM基因的遺傳、分子和生化方面在環(huán)境適應(yīng)性方面的研究領(lǐng)域?qū)⑹茄芯康臒狳c(diǎn)。

展望

落葉果樹芽休眠現(xiàn)象受基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，很難從單個(gè)或幾個(gè)基因的作用解釋休眠的本質(zhì)，必須全面系統(tǒng)地研究多基因的協(xié)同作用。為此，今后關(guān)于落葉果樹芽休眠的基因調(diào)控研究可從以下幾方面開展。1）從研究手段來看，除傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法外，可結(jié)合現(xiàn)代基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等手段，綜合利用這些組學(xué)的手段來研究落葉果樹芽休眠的誘導(dǎo)、維持和解除的過程。2）從研究內(nèi)容來看，除在休眠解除的調(diào)控方面，還應(yīng)深入開展休眠誘導(dǎo)、維持階段的基因調(diào)控研究。3）落葉果樹芽休眠的基因調(diào)控研究不能僅局限在單個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)模式上，采用多種研究手段，建立芽休眠的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，開展基因的分子功能研究，明確休眠相關(guān)的調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因。通過這些方面，從而不斷完善和揭示芽休眠相關(guān)基因的途徑及在休眠誘導(dǎo)、維持和解除過程中的協(xié)同作用，從本質(zhì)上揭示這一被稱為“生命的隱蔽現(xiàn)象”。