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本文作者：雷先德1,2李金文1徐秀玲1,2張翰林1,2曹林奎1作者單位：1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)開放重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

長(zhǎng)期大量施用化肥、農(nóng)藥,導(dǎo)致土壤板結(jié),易缺氧,土壤酶活性及微生物多樣性降低。近年來,上海都市農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展迅速,尤其是蔬菜生產(chǎn),在實(shí)際生產(chǎn)中,大部分菜農(nóng)為了片面追求高產(chǎn)而忽視品質(zhì),大量使用化肥,特別是氮肥的過量施用現(xiàn)象非常普遍。然而,近年來國(guó)家統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)農(nóng)業(yè)資源消耗,包括化肥、農(nóng)藥等的用量增長(zhǎng)速率與農(nóng)業(yè)增產(chǎn)量不呈正比,并導(dǎo)致品質(zhì)下降[14]。相關(guān)研究調(diào)查顯示,這些化肥的利用率僅為35%左右,其余未被利用的大部分都變成了污染源,造成水體、空氣和土壤污染等環(huán)境問題[58]。為了解決農(nóng)作物高產(chǎn)與化肥過量施用而引起環(huán)境污染之間這一突出矛盾,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)開放重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展了長(zhǎng)期的農(nóng)田污染源頭控制與過程治理的研究工作,并且創(chuàng)新開發(fā)出了一種農(nóng)用功能微生物菌劑。本試驗(yàn)以該微生物菌劑為試驗(yàn)材料,應(yīng)用于葉菜類菠菜,探討化肥減量化技術(shù)對(duì)菠菜營(yíng)養(yǎng)吸收利用的影響,研究微生物菌劑對(duì)菠菜的促生效應(yīng),并應(yīng)用PCR-DGGE(變性凝膠梯度電泳)等現(xiàn)代分子生物學(xué)的手段[89],研究化肥減量與微生物菌劑配施處理方式對(duì)土壤微生物種群多樣性的影響,旨在為從源頭控制農(nóng)業(yè)面源污染,保護(hù)水源地生態(tài)健康,減少化肥用量,推廣環(huán)保節(jié)能的農(nóng)用混合微生物菌劑提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試菠菜品種為河北佳禾種子公司提供的大葉菠菜;供試菌劑由河北省科學(xué)院微生物研究所提供的硅酸鹽菌劑和上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離純化培養(yǎng)的自生固氮菌液,二者進(jìn)行混合培養(yǎng)而形成的混合菌液。該混合菌液具有溶磷、解鉀及固氮等功能,主要菌株為Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌數(shù)大于2×108cfu•mL1。選用直徑30cm、高30cm的花盆。試驗(yàn)前每處理每盆等量施用30.55g有機(jī)肥,有機(jī)肥的有機(jī)質(zhì)含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有機(jī)肥與土壤拌勻。本試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)不同處理,每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)(見表1)。菠菜定植密度為7株•盆1。試驗(yàn)所用氮肥為尿素,磷肥為過磷酸鈣,鉀肥為硫酸鉀以及上海雨霖牌生物有機(jī)肥料。第1季菠菜從2010年11月20日播種開始,到2011年1月24日收割結(jié)束;第2季從2011年3月8日到2011年5月5日。供試土壤采自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院試驗(yàn)田,土壤類型為褐壤土,試驗(yàn)前土壤理化性質(zhì)背景指標(biāo)測(cè)定如下:土壤全氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量分別為1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,電導(dǎo)率(Ec值)為1.84mS•cm1,pH為7.25。試驗(yàn)期間人工澆水,根據(jù)菠菜不同生長(zhǎng)期的需要,每1~5d澆水1次。

1.2菠菜測(cè)定分析

在第1季菠菜六葉期(2010年12月20日14:00)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期(2011年1月24日14:00),每盆隨機(jī)抽取3株,挑選每株新長(zhǎng)出的成熟葉片,使用SPAD-502儀測(cè)定葉綠素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL葉綠素?zé)晒鈨x、經(jīng)暗適應(yīng)30min后,測(cè)定菠菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù),每處理9次重復(fù)。2011年1月24日,菠菜收割當(dāng)天,用紫外分光光度法測(cè)定菠菜可食部分硝酸鹽含量,每樣品3次重復(fù)。電子天平計(jì)量菠菜收割產(chǎn)量,每盆單獨(dú)收割測(cè)產(chǎn);菠菜N、P、K含量由上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心測(cè)定,其中N使用Elementer公司元素分析儀(EAI)測(cè)定,P、K使用離子光譜儀(ICP)分析測(cè)定,每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.3土壤樣品采集與處理

試驗(yàn)期間,分別在菠菜六葉期(2010年12月20日)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期(2011年1月24日)兩次采集土樣。使用不銹鋼取土器采集0~15cm土層,部分土壤放于20℃冰箱冷凍保存,另一部分土壤樣品風(fēng)干后研磨,分別過2mm篩和0.45mm篩,塑料袋封裝保存,待測(cè)。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤總DNA的提取、16SrDNAV3區(qū)片段PCR擴(kuò)增

每個(gè)樣品取0.5g土樣提取DNA,本試驗(yàn)采用Omega公司生產(chǎn)的soilDNAKit提取土壤微生物基因組DNA,按試劑盒使用說明的操作步驟進(jìn)行。將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對(duì)F341GC和R517,其序列分別為:（略）。GC夾(下劃線)的目的是為了防止在DGGE過程中,引物的完全分離的擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50μL,PCR反應(yīng)采用降落PCR策略,即:預(yù)變性條件為96℃5min,前20個(gè)循環(huán)為94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0.5℃),后10個(gè)循環(huán)為94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突變檢測(cè)系統(tǒng)(CBS)對(duì)16SrDNAV3區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。使用梯度膠制備裝置,變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7mol•L1的尿素和40%的去離子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%;在150V的電壓下,上樣量為18μL。其運(yùn)行條件為:0.5×TAE電泳緩沖液,60℃電泳條件下,150V,10h。電泳完畢后,再用去離子水漂洗,固定15min,染色15min,顯色10min。在圖像處理過程中,對(duì)于在DGGE電泳圖上是肉眼可見、但被軟件忽略掉的一些小條帶進(jìn)行了手動(dòng)處理,條帶的密度由該軟件自動(dòng)算出。

1.4.3指紋圖譜的處理與分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所擴(kuò)增的DGGE條帶的數(shù)量可代表群落DNA序列的豐富度(S),群落DNA序列的多樣性可采用Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)來表示,Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)計(jì)算公式為:（略）。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2003及SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析,用單因素方差分析及鄧肯檢驗(yàn)(DMRT)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。采用Bio-rad公司Quantityone軟件的UPGAMA程序進(jìn)行微生物群落的聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1菌劑處理對(duì)菠菜生長(zhǎng)特性和產(chǎn)量的影響

2.1.1對(duì)菠菜營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響

通過對(duì)菠菜葉片葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定結(jié)果顯示(表2),不同施肥處理間差異明顯。各處理相比,就兩次測(cè)定的葉綠素含量的變化,T2、T3、T4、T5處理增幅較大,其中T1增加24.2%,而T5則達(dá)到45.6%。最后測(cè)定各處理的葉綠素含量差異為:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。結(jié)果說明,化肥對(duì)葉綠素合成量的影響在菠菜生長(zhǎng)前期影響更為明顯,且常規(guī)化肥處理(T1)為最大;而在生長(zhǎng)后期,隨著微生物菌劑在環(huán)境中的定植與適應(yīng),在土壤中繁殖量顯著提高,活性顯著增強(qiáng),對(duì)菠菜的作用逐漸顯現(xiàn),相反,化肥的作用卻呈下降趨勢(shì),從而導(dǎo)致最終化肥減量20%和40%的處理比完全用化肥的葉綠素含量要高?？梢?化肥作為速效性肥料對(duì)菠菜生長(zhǎng)影響較快,作用時(shí)間較短,成本較高;而菌劑與化肥的混施,不但更能提高葉綠素含量,且作用時(shí)間長(zhǎng),成本也更低。Fv/Fm指標(biāo)反映菠菜葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù),是葉片光合系統(tǒng)II原初光能轉(zhuǎn)換效率,即可變熒光產(chǎn)量與最大熒光產(chǎn)量之比。測(cè)定結(jié)果顯示,相比對(duì)照處理,使用菌劑的T2、T3、T4和T5處理的Fv/Fm都有所提高,其中T3達(dá)到0.797,比對(duì)照提高0.012,處理間差異顯著。由此可見,菌劑處理的菠菜在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中的光能轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于不施肥CK。添加微生物菌劑的處理與純粹使用化肥的T1處理差異不顯著。菠菜對(duì)化肥及土壤中N、P、K等養(yǎng)分的吸收直接表現(xiàn)為各元素在植株體內(nèi)的含量。由表2可知,在收割期,各處理間菠菜N含量存在顯著差異。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK處理最低,且T2處理較CK處理的增幅為100%。由此可見,菌劑處理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,減少了N損失。菠菜收割后植株P(guān)、K含量以T1處理為最低,分別約為35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明顯低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生長(zhǎng)后期,T1處理的菠菜對(duì)P、K的吸收較少,土壤中有效磷和速效鉀含量低。相比T1處理,T2和T5處理反而有所提高,表明硅酸鹽菌的溶磷、解鉀作用促進(jìn)了菠菜對(duì)P的吸收利用量,使菠菜P含量較純化肥處理的T1要高。微生物菌劑的兩種菌各自發(fā)揮了其主要功能,固氮菌保持了較低氮肥使用條件下的高N含量,硅酸鹽菌確保了較低磷肥和鉀肥使用條件下的高P、K含量。

2.1.2對(duì)菠菜硝酸鹽含量的影響

收割后將菠菜全株(包括根、莖、葉)搗碎后測(cè)定硝酸鹽含量。由表3可知,與不施肥(CK)處理相比,施肥處理對(duì)菠菜硝酸鹽含量影響較大,使硝酸鹽含量顯著增加。其中,T1處理的硝酸鹽增量最為明顯,達(dá)到5866.52mg•kg1,T2最小,為4358.23mg•kg1,T3、T4和T5處理在4677.55~5078.25mg•kg1之間。由此可見,T2、T3、T4、T5處理與T1處理相比,硝酸鹽含量明顯降低。因此,菌劑的配合施用與純施化肥相比,可以提高菠菜品質(zhì),有利于生產(chǎn)有機(jī)健康蔬菜。

2.1.3對(duì)菠菜產(chǎn)量的影響

根系是植物從土壤獲取養(yǎng)分的必要器官,但作為可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占總生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相對(duì)減少,產(chǎn)量就相對(duì)降低。表3表明,固氮溶磷解鉀菌劑配合施用后,與不施肥對(duì)照相比,根生物量比重有明顯降低,由4.36%下降到3.02%,降低約30%,比化肥T1處理的3.54%也有降低。由此說明,功能菌劑的配施不僅促進(jìn)了菠菜根系的生長(zhǎng),而且提高了養(yǎng)分及光合產(chǎn)物的有機(jī)分配,從而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜產(chǎn)量,有效提高了菠菜的經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)包括兩季菠菜,產(chǎn)量計(jì)算為兩季的總產(chǎn)量。其中,第1季為2010年冬季菠菜,第2季為2011春季菠菜。試驗(yàn)表明,菠菜產(chǎn)量受所施用肥料的影響較大,施肥對(duì)菠菜產(chǎn)量提高效果明顯。由表3可知,不同處理間每盆菠菜的平均產(chǎn)量差異顯著。與CK處理相比,T4處理的產(chǎn)量增加最大,每盆平均產(chǎn)量達(dá)到277.73g,產(chǎn)量增加170%;T3、T2、T5和T1處理的增產(chǎn)量依次減少,平均每盆產(chǎn)量分別為267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥減量施用的T2、T3、T4和T5處理產(chǎn)量均比常規(guī)化肥用量T1處理產(chǎn)量高,達(dá)到了化肥減量而不減產(chǎn)甚至增產(chǎn)的效果。由此可見,菌劑可以替代部分化肥,減少農(nóng)業(yè)化肥用量。

2.2菌劑處理對(duì)菠菜土壤微生物多樣性的影響

2.2.1土壤微生物DGGE指紋圖譜分析

對(duì)不同處理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可變區(qū)片斷進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析的結(jié)果(圖1a)表明,不同施肥處理下盆栽菠菜土壤的微生物基因區(qū)系條帶出現(xiàn)較小差別。與CK相比,各處理除T1外,條帶亮度略有增加,條帶數(shù)量無明顯差別。從圖1b16SrDNAV3區(qū)PCR擴(kuò)增片段DGGE泳道圖譜可以看出,多數(shù)的明顯條帶在遷移率上基本一致,說明不同處理間具有大量的共有微生物種群,這主要是存在于試驗(yàn)土壤中的土著微生物。微生物菌劑處理的明亮條帶明顯在圖譜中部多出現(xiàn)1~2個(gè)條帶,表明混合微生物菌劑與化肥的配施,提高了土壤主要微生物種群基因多樣性和數(shù)量。由于試驗(yàn)在低溫的冬春季進(jìn)行,土壤微生物本身活性也較低,生長(zhǎng)繁殖速率較慢,因而不同施肥制度對(duì)微生物種群與數(shù)量的影響反映不夠明顯。

2.2.2土壤微生物DGGE條帶圖譜的聚類分析

不同施肥處理間的土壤微生物種群相似性表現(xiàn)為DGGE條帶聚類分析的相似性系數(shù),相似性系數(shù)越高,種群多樣性越趨于一致,如圖2所示。本試驗(yàn)中,T4和T5處理間的土壤微生物種群相似性最高,達(dá)到0.80,被聚為一類,與T1處理的相似性系數(shù)為0.76,同時(shí)與CK都聚在一個(gè)大類;而T2和T3處理又被單獨(dú)聚在一類,相似性系數(shù)為0.70;兩個(gè)大類間最低相似性系數(shù)也達(dá)到0.65。一般認(rèn)為相似值高于0.60的兩個(gè)群體具有較好的相似性,將6個(gè)樣品歸為一類的相似值達(dá)0.65,說明種植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物種群DNA多樣性分析

對(duì)不同處理土壤的微生物16SrDNA的DGGE條帶進(jìn)行香農(nóng)威爾多樣性指數(shù)(Shannon-Wiernerindex)分析,結(jié)果見表4。從表4可以看出,豐富度指數(shù)以T1處理最低,T3處理最高,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)有所降低,而添加微生物菌劑的則有所提高;而Shannon-Wierner指數(shù)在各處理間差異較為明顯,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細(xì)菌多樣性有所降低,而添加微生物菌劑的各處理卻有明顯提高。該結(jié)果表明,常規(guī)化肥處理不利于提高土壤微生物種群多樣性;相反,在化肥減量情況下,配施有益的微生物菌劑,有利于改善土壤中主要微生物種群結(jié)構(gòu),提高微生物種群多樣性。

3討論與結(jié)論

本研究中,施用微生物菌劑顯著提高了菠菜葉綠素含量,以T5和T4處理最好;顯著提高了菠菜對(duì)NPK養(yǎng)分的吸收與轉(zhuǎn)化,以T5和T2處理最好;而對(duì)葉綠素?zé)晒鈪?shù)作用不明顯;菠菜硝酸鹽含量為常規(guī)化肥處理>化肥減量20%處理>化肥減量40%處理>不施肥CK處理。微生物菌劑部分替代化肥引起菠菜硝酸鹽含量減少,從而提高了菠菜品質(zhì)。土壤中有效氮、磷、鉀養(yǎng)分的持續(xù)供給是影響菠菜營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段重要的因素[3],本試驗(yàn)中,微生物菌劑具有這方面功能。當(dāng)環(huán)境中有效養(yǎng)分充足,菠菜生長(zhǎng)期延長(zhǎng),長(zhǎng)得更高更壯,最大限度地增加生物量,提高產(chǎn)量。本研究中菠菜產(chǎn)量以添加微生物菌劑并減少化肥用量40%的處理最好,各處理間差異顯著。與CK相比,T4處理增產(chǎn)幅度最高,達(dá)到170%,與T1相比,也增產(chǎn)26.2%,這與前人的研究結(jié)論一致。崔美華等[910]研究表明,微生物菌劑對(duì)東北水稻的增產(chǎn)率達(dá)13.5%。這是因?yàn)槲⑸锞鷦┑挠幸婢涸谕寥乐卸ㄖ澈?分泌有機(jī)酸可以溶解釋放出被土壤顆粒等吸附的NPK養(yǎng)分,從而延長(zhǎng)了土壤NPK養(yǎng)分的有效供給,促進(jìn)了菠菜營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)?？梢?微生物菌劑應(yīng)用的增產(chǎn)效果明顯。

許多研究報(bào)道指出,土壤微生物群體變化與施肥類型和施肥用量有關(guān)[1113]。施無機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性及活性的影響,目前的尚有爭(zhēng)議[1415]。并且,由于目前技術(shù)的制約,PCR-DGGE技術(shù)體系只能研究土壤中微生物量較大的種群,不能完全反映土壤中所有微生物種群數(shù)量。Sarathandra等[16]研究新西蘭漢密爾頓的兩個(gè)砂壤土試驗(yàn)區(qū)施肥對(duì)土壤微生物的影響,結(jié)果顯示無機(jī)肥對(duì)土壤微生物群落有一定的影響。本試驗(yàn)中以T3處理土壤微生物多樣性最好,豐富度指數(shù)為13、Shannon-Wierner指數(shù)為0.983,常規(guī)化肥處理(T1)最差,與Sarathandra等[16]的研究一致。表明微生物菌劑能夠保持和提高土壤微生物豐富度指數(shù)和香農(nóng)威爾(Shannon-Wierner)多樣性指數(shù),穩(wěn)定農(nóng)田土壤環(huán)境中微生物種群多樣性;常規(guī)化肥處理導(dǎo)致土壤微生物種群多樣性的降低。值得注意的是,本研究各處理的生物種群豐富度均不高,與Duan等[17]研究結(jié)果有一定差異。此外,土壤溫度、有機(jī)質(zhì)含量也是影響微生物種群數(shù)量的重要因素,溫度太低、有機(jī)質(zhì)過少都不利于微生物增殖與外來種的定植[18]。由于農(nóng)田土壤環(huán)境中微生物種群多樣性受試驗(yàn)田長(zhǎng)期試驗(yàn)、土壤有機(jī)質(zhì)較少、試驗(yàn)環(huán)境溫度低的影響,各試驗(yàn)結(jié)果的總體物種豐富度不高。鑒于此,以后可選擇固定試驗(yàn)田或土壤中進(jìn)行長(zhǎng)期試驗(yàn),進(jìn)一步研究長(zhǎng)期穩(wěn)定施肥處理?xiàng)l件下微生物菌劑對(duì)土壤微生物多樣性的影響。