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本文作者：鄭桂玲1周洪旭1耿以龍2杜方嶺3王未名3李長友1作者單位：1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護學(xué)院2.青島市森林病蟲害防治工作站3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究所

美國白蛾屬鱗翅目燈蛾科，是一種世界性的檢疫害蟲，原產(chǎn)于北美，1979年傳入我國，其寄主范圍廣泛，喜食的植物主要有桑、白蠟、法桐、臭椿、榆、楊、柳等，其成蟲產(chǎn)卵量大，幼蟲具有暴食性，對我國林業(yè)和園林綠化造成嚴重損失。對美國白蛾采取安全有效并與環(huán)境友好的生物防治措施非常重要［1］，美國白蛾核型多角體病毒(hcnpv)對防治美國白蛾幼蟲具有高效、專一和安全等優(yōu)點，可有效降低化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染，可以大面積應(yīng)用［2－4］。但病毒作為殺蟲劑在應(yīng)用之前，首先要解決大量增殖問題。目前，采用活蟲體進行增殖依然是獲得大量病毒的主要途徑［5］，蟲齡和接種濃度(劑量)是影響病毒大量增殖的主要因素［6－7］。2008年作者從青島市郊區(qū)美國白蛾病死幼蟲體內(nèi)分離了1株美國白蛾核型多角體病毒，作者對幼蟲齡期、接種劑量及其組合對該HcNPV產(chǎn)量的影響進行了研究，篩選出適合大量增殖的最佳條件，以期為該病毒的大量增殖和病毒殺蟲劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1．1材料

美國白蛾采集于青島市城陽區(qū)，在室內(nèi)用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)，選取大小一致的健康幼蟲，供試驗用。美國白蛾人工飼料參照隋賀等的配方［8］。美國白蛾核型多角體病毒為本室2008年從青島市城陽區(qū)病死的美國白蛾幼蟲體內(nèi)分離的毒株。

1.2方法

1.2.1病毒的提取和病毒懸液的制備

用4齡美國白蛾幼蟲增殖HcNPV青島分離株，收集病毒致死幼蟲。用0.2%次氯酸鈉消毒幼蟲5min，滅菌水沖洗2遍，加入滅菌水，將死蟲用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過濾。病毒提取采用差數(shù)離心法，濾液經(jīng)500r/min離心15min，棄沉淀，上清液采用5000r/min離心20min，如此重復(fù)3次，獲得病毒多角體懸液，血球計數(shù)板計數(shù)測得病毒濃度，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2飼毒和飼養(yǎng)方法

設(shè)飼毒蟲齡分別為4，5，6齡;飼毒劑量分別為1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭，共15個處理。將人工飼料切割成5mm2的小片，放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1塊，取HcNPV分別稀釋成1.48×108，1.48×107，1.48×106，1.48×105，1.48×104OBs/mL，每塊飼料滴加以上各濃度病毒液10μL，以滴加滅菌水作為對照，分別飼喂4，5，6齡美國白蛾幼蟲，24h后選取吃光飼料的幼蟲放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每盒15頭，每處理30頭幼蟲，3次重復(fù)，每天檢查并更換新鮮人工飼料，待幼蟲發(fā)病后鏡檢，每天觀察2次，將不同處理的病死蟲分別收集，并記錄死蟲數(shù)量，直到幼蟲化蛹為止。

1.2.3病毒產(chǎn)量測定

將每一處理的病死蟲分別用研磨器研磨勻漿，稀釋后3層紗布過濾，濾液采用5000r/min離心20min沉淀病毒，用無菌水懸浮后定容稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)測得病毒濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)、定容體積和死蟲數(shù)計算平均單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量，同時根據(jù)幼蟲死亡率計算百頭幼蟲的病毒總產(chǎn)量，病毒總產(chǎn)量的計算方法為單頭幼蟲病毒產(chǎn)量×死亡率(%)×100。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1蟲齡、病毒劑量及其組合對單頭幼蟲病毒產(chǎn)量的影響

測定了4，5，6齡幼蟲分別接種1.48×106，1.48×105，1.48×104，1.48×103，1.48×102OBs/頭劑量時單頭美國白蛾幼蟲病毒多角體的產(chǎn)量。方差分析(數(shù)據(jù)略)結(jié)果表明，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對單頭幼蟲病毒產(chǎn)量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是蟲齡，其次是劑量以及蟲齡和劑量的組合。單頭幼蟲病毒的產(chǎn)量隨著蟲齡的增大而明顯增加，接種6齡幼蟲的平均單頭幼蟲病毒產(chǎn)量最高，其次為5齡幼蟲的產(chǎn)量，而4齡幼蟲的產(chǎn)量最低，6齡、5齡與4齡幼蟲之間差異極顯著，結(jié)果見表1。6齡幼蟲病毒產(chǎn)量為4齡幼蟲病毒產(chǎn)量的2.99倍，5齡幼蟲病毒產(chǎn)量為4齡幼蟲的2.67倍，接種病毒時蟲齡越高，蟲體越大，單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量越高。

2.2蟲齡、病毒劑量及其組合對幼蟲死亡率的影響

對蟲齡、劑量以及蟲齡和劑量的組合影響幼蟲死亡率的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果表明，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對幼蟲死亡率的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲齡，最后是蟲齡和劑量的組合。各齡幼蟲的死亡率與劑量呈正相關(guān)，死亡率隨著劑量的增大而增加;在相同劑量下，死亡率與蟲齡呈負相關(guān)，幼蟲死亡率隨著蟲齡的增大而減小(數(shù)據(jù)見表2)。

2.3蟲齡、病毒劑量及其組合對病毒總產(chǎn)量的影響

對蟲齡、劑量以及蟲齡和飼毒劑量的組合影響病毒總產(chǎn)量的情況進行的統(tǒng)計和方差分析顯示，蟲齡、劑量以及蟲齡與劑量的組合對病毒總產(chǎn)量的影響均極顯著，其中最主要的影響因子是劑量，其次是蟲齡，最后為蟲齡和劑量的組合。蟲齡和劑量的不同組合對單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量以及幼蟲死亡率等2個決定病毒總產(chǎn)量的因素均有影響，進而對病毒總產(chǎn)量產(chǎn)生影響。由表2可見，在室內(nèi)大量增殖HcNPV時，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲均可以獲得最高的病毒產(chǎn)量，百頭幼蟲的病毒總產(chǎn)量可分別達到1.55×1011OBs和1.50×1011OBs。

3結(jié)論與討論

病毒的大量增殖是其作為殺蟲劑生產(chǎn)和應(yīng)用的前提，本文對美國白蛾核型多角體病毒增殖時蟲齡、接種劑量及其組合的影響進行的測定和分析結(jié)果表明，蟲齡、劑量及其組合對單頭幼蟲病毒產(chǎn)量、幼蟲死亡率和病毒總產(chǎn)量均具有顯著影響。病毒總產(chǎn)量取決于單頭幼蟲病毒產(chǎn)量和死亡率的大小，而單頭幼蟲病毒產(chǎn)量和死亡率會受到蟲齡、劑量以及二者的相互作用等影響。單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量隨著蟲齡的增大而增加，而隨著劑量的增加呈降低趨勢;幼蟲死亡率則隨劑量的增大而增加，隨蟲齡的增大而降低。因此，為獲得最高的病毒總產(chǎn)量，需要綜合分析，篩選用于增殖病毒的最佳蟲齡和劑量組合。

本研究表明，在室內(nèi)大量增殖HcNPV時，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲均可以獲得最高的病毒產(chǎn)量，百頭幼蟲的病毒總產(chǎn)量可達到1．55×1011OBs和1．50×1011OBs，而單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量最高可達2．319×109OBs，與艾德洪等［2］報道的用5．5×107PIB/mL的病毒感染4齡美國白蛾幼蟲可獲得最高的多角體收獲量的結(jié)果有所不同，這可能是不同的毒株在殺蟲毒力和殺蟲速度上的差異引起的。影響病毒增殖產(chǎn)量的最主要因子是飼毒時的蟲齡和劑量(或濃度)［6－7］，此外還有報道，持續(xù)飼毒時間、溫度和光照周期等因子也會不同程度的影響病毒的產(chǎn)量［9］。本文主要對影響病毒產(chǎn)量的2個關(guān)鍵因子進行了分析，其它因子對其產(chǎn)量是否產(chǎn)生影響以及影響的大小，有待進一步測定和分析。