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本文作者：王亞男1曾希柏1俄勝哲2白玲玉1李蓮芳1蘇世鳴1沈靈鳳1作者單位：1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所

結(jié)果與分析

1氨氧化細(xì)菌的T-RFLP分析

將土壤樣品的amoA功能基因用MspI內(nèi)切酶酶切后，得到4個(gè)主要片段長(zhǎng)度，分別是60bp、156bp、235bp和256bp。對(duì)主要片段進(jìn)行分析后得到圖1?？梢钥闯?，不同施肥對(duì)0~20cm和20~40cm土層中156bp和256bp兩個(gè)片段百分比變化的影響較小。156bp在各個(gè)樣品中平均約占5%，最大不超過(guò)9%；256bp在各個(gè)樣品中平均約占10%，最大不超過(guò)17%。但是，不同處理間TRFs的主要片段60bp和235bp則有較明顯差異，其中235bp片段所占比例較高，最大達(dá)到62%。同一土層中，235bp片段一般以CK和NPK處理較高。不同土層比較，0~20cm土層中60bp片段以M處理最高，235bp則以NPK處理最高；20~40cm土層中60bp片段以MNPK處理最高，235bp則以CK處理最高。對(duì)相關(guān)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表3）可以看出，施肥對(duì)60bp、235bp和256bp片段的百分比都有顯著影響，而土壤層次則主要影響60bp和235bp兩個(gè)片段。不同施肥處理間片段百分比的變化幅度明顯要大于土層間的變幅。說(shuō)明在設(shè)施栽培條件下，土壤中氨氧化細(xì)菌的狀況受施肥的影響更大。

2土壤氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

在本研究中，挑選氨氧化細(xì)菌片斷較豐富的樣品（MNPK第二個(gè)重復(fù)的0~20cm土層樣品）進(jìn)行克隆文庫(kù)構(gòu)建。選取52個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序分析，將克隆測(cè)序的結(jié)果與典型氨氧化細(xì)菌進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。圖2所示的測(cè)序結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所處條件下土壤中氨氧化細(xì)菌的所有序列均屬于β-變形菌門(mén)，主要包括Nitrosospiracluster3a、Nitrosospiracluster3b和Nitrosomanascluster7三個(gè)屬。其中屬于Nitrosospiracluster3a的片段包括60bp、235bp和256bp，屬于Nitrosospiracluster3b的片段包括60bp和156bp，還有一部分60bp的片段屬于Nitrosomanascluster7。235bp和256bp為Nitrosospiracluster3a氨氧化細(xì)菌特有，156bp為Nitrosospiracluster3b氨氧化細(xì)菌特有，而60bp片段則分布在3個(gè)cluster中。Ni－trosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b這兩個(gè)屬的氨氧化細(xì)菌的序列由于都屬于Nitrosospiracluster3，其相似度高，很難通過(guò)酶切分型將其完全區(qū)別。為進(jìn)一步將屬于Nitrosospira和Nitrosomanas這兩個(gè)屬的氨氧化細(xì)菌分開(kāi)，選用BsaJI酶對(duì)測(cè)得的序列作進(jìn)一步分析。發(fā)現(xiàn)屬于Nitrosomanascluster7的氨氧化細(xì)菌用BsaJI酶酶切后，酶切片段長(zhǎng)度為319bp，而屬于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b的氨氧化細(xì)菌酶切后得到的主要片段長(zhǎng)度為60bp、67bp、118bp、155bp和484bp，利用MspI和BsaJI這兩種內(nèi)切酶對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以將氨氧化細(xì)菌Nitrosospira和Nitrosomanas兩個(gè)屬的片段加以區(qū)別。

3氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性列于圖3?？梢钥闯觯毖趸?xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤有機(jī)質(zhì)（r=0.461，F(xiàn)=23.915，P=0.002）、全磷（r=0.304，F(xiàn)=1243，P=0.002）、pH值（r=0.241，F(xiàn)=8.883，P=0.004）和硝態(tài)氮（r=0.177，F(xiàn)=6.020，P=0.018）含量等均呈顯著相關(guān)，而與土壤全鉀含量無(wú)相關(guān)性。由于土壤有機(jī)質(zhì)和pH值等理化指標(biāo)的變化在很大程度上與施肥及管理等因素密切相關(guān)，可以認(rèn)為土壤中氨氧化細(xì)菌的群落在很大程度上受耕作和施肥的影響。

4施肥對(duì)氨氧化細(xì)菌豐度的影響

本研究中，對(duì)不同施肥處理下土壤中氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)的變化情況進(jìn)行了相應(yīng)分析，其結(jié)果如圖4。不同施肥處理、不同土層的氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)均有明顯差異。其中，CK和M處理土壤中氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)均較低，而1/2MNPK和NPK處理土壤中amoA基因拷貝數(shù)則一般均較高。MNPK處理下土壤中氨氧化細(xì)菌的基因拷貝豐度并沒(méi)有因?yàn)槭┓柿枯^高而達(dá)到最大，在0~20cm土層中反而低于1/2MNPK和NPK處理，在20~40cm土層中亦低于1/2MNPK處理。在0~20cm和20~40cm兩個(gè)土層中，氨氧化細(xì)菌的豐度均以1/2MNPK處理最高，amoA基因拷貝數(shù)分別達(dá)到每克土9.95×107拷貝數(shù)和每克土6.65×107拷貝數(shù)，比CK處理增加105.0%和315.3%。根據(jù)氨氧化細(xì)菌amoA功能基因拷貝數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，施肥對(duì)氨氧化細(xì)菌豐度具有顯著影響（P=0.028<0.05），而不同土層間比較，氨氧化細(xì)菌豐度無(wú)明顯差異（P>0.05）。

討論

本文采用PCR-TR－FLP與定量PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了設(shè)施菜地不同施肥下氨氧化細(xì)菌的種類(lèi)及豐度變化。氨氧化細(xì)菌功能基因amoA經(jīng)過(guò)MspI酶酶切后主要得到了4個(gè)片段，且每個(gè)樣品中都包含這4個(gè)片段，只是它們所占百分比不同。將T-RFLP結(jié)果與克隆測(cè)序結(jié)果結(jié)合分析后發(fā)現(xiàn)，研究土壤中氨氧化細(xì)菌包括Nitrosospira和Nitrosomanas兩個(gè)屬，Nitrosospira屬的氨氧化細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)種群，占90%左右，Nitrosomanas屬的氨氧化細(xì)菌僅占10%左右。該結(jié)果與Kowalchuk等[19]報(bào)道的土壤中硝化細(xì)菌以Nitrosospira屬為主，而非Nitroso－manas屬的結(jié)論一致，也與很多研究[20]認(rèn)為的Ni－trosospira細(xì)菌在氨氧化過(guò)程中發(fā)揮主要作用一致。但與Fan等[21]和Li等[22]報(bào)道不盡一致的是，本研究中除以Nitrosospira屬氨氧化細(xì)菌為主外，還含有少部分Nitrosomanas屬的氨氧化細(xì)菌，說(shuō)明受設(shè)施環(huán)境及施肥的影響，氨氧化細(xì)菌的種類(lèi)可能會(huì)變得更豐富。本研究設(shè)施土壤中大部分氨氧化細(xì)菌屬于Nitrosospiracluster3，各處理中均以Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b為優(yōu)勢(shì)種群，只是所占比例有差別。一般認(rèn)為，不同氮素濃度會(huì)引起氨氧化細(xì)菌種屬的改變，這是由于不同類(lèi)型氨氧化細(xì)菌對(duì)基質(zhì)[23]和銨濃度的敏感度不同所致[24]。Kowalchuk的研究中施用氮肥刺激了Nitrosospiracluster3的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬[25]，Belse等[26]亦認(rèn)為在銨濃度較高的條件下，Nitrosospiracluster3能夠更好地生長(zhǎng)。但是，Avrahami等[17]指出Nitrosospiracluster3不一定需要在較高銨濃度下才能成為優(yōu)勢(shì)菌屬，Chu等[8]發(fā)現(xiàn)在不施肥處理下Nitrosospiracluster3也是優(yōu)勢(shì)菌屬。本研究亦證實(shí)，Nitrosospiracluster3不僅在施用高氮條件下是優(yōu)勢(shì)菌屬，即使在氮肥施用適中、甚至不施氮肥的對(duì)照處理中，Nitrosospiracluster3也是優(yōu)勢(shì)菌屬。Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b對(duì)銨濃度的要求表現(xiàn)出不同的趨向性[17]。Chu等[8]研究表明，長(zhǎng)期施用氮肥后，土壤中Nitrosospiracluster3a氨氧化細(xì)菌的豐度明顯增加。本研究中，由于60bp片段同時(shí)屬于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b兩個(gè)屬，即使用BsaJI酶切仍不能將兩個(gè)屬的完全分開(kāi)，所以不能準(zhǔn)確區(qū)分出Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b這兩個(gè)屬百分比的變化。有機(jī)質(zhì)可以為自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)提供豐富的養(yǎng)分，因此有機(jī)質(zhì)含量豐富的土壤中，如表層和施用有機(jī)肥的土壤中，氨氧化細(xì)菌的多樣性和豐度也較高。施肥會(huì)引起土壤pH值的變化，尤其是長(zhǎng)期施用化肥會(huì)導(dǎo)致土壤酸化。很多研究表明，土壤pH值是影響硝化作用的重要因素[13]，低pH值可限制硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)，不利于硝化過(guò)程的進(jìn)行，從而影響土壤氮素循環(huán)。pH值也是影響氨氧化細(xì)菌和古菌群落多樣性、數(shù)量和活性的主要因素[27]。本研究通過(guò)T-RFs片段分析同樣得出有機(jī)質(zhì)和pH值與氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有十分顯著的相關(guān)性。氨氧化細(xì)菌不僅對(duì)土壤中氮素轉(zhuǎn)化具有十分重要的作用，而且也是土壤中更容易受到外界條件變化影響的一類(lèi)微生物。傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)培養(yǎng)法很難精確估算出環(huán)境條件對(duì)氨氧化細(xì)菌這類(lèi)難以在人工條件下培養(yǎng)的微生物豐度的影響。采用熒光定量PCR技術(shù)不僅可以解決以上問(wèn)題，而且可以準(zhǔn)確反映微生物的細(xì)微變化。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究氨氧化細(xì)菌數(shù)量的變化已經(jīng)有很多報(bào)道，如Okano等[11]利用real-timePCR研究了不同銨濃度對(duì)氨氧化細(xì)菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量隨銨濃度的增加而增加，最高達(dá)到每克土6.6×107個(gè)細(xì)胞。Hermansso等[10]的研究也指出，施氮處理的土壤中氨氧化細(xì)菌數(shù)量達(dá)到每克干土6.2×107拷貝數(shù)，比不施肥處理的土壤高出3倍多。在本研究中，氨氧化細(xì)菌豐度的最大值并不是出現(xiàn)在施肥量最高的MNPK處理，而是出現(xiàn)在1/2MNPK處理0~20cm土層，amoA基因數(shù)達(dá)到每克干土9.95×107拷貝數(shù)。該結(jié)果與前人的結(jié)果并不完全一致[11]，說(shuō)明對(duì)于設(shè)施菜地而言，由于環(huán)境條件與大田差異明顯，施肥的影響也可能因此而有所差別。同一施肥處理下，一般0~20cm土層中氨氧化細(xì)菌的豐度高于20~40cm土層，這是因?yàn)楸韺油寥乐醒鯕庀鄬?duì)充足且土壤肥力較高，更適宜好氧型氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)。

結(jié)論

本文采用T-RFLP和定量PCR結(jié)合的技術(shù)，系統(tǒng)研究設(shè)施菜地不同施肥處理后氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化。結(jié)果表明：（1）設(shè)施菜地土壤中氨氧化細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌為Ni－trosospiracluster3屬，但也包括有少量的Nitroso－manascluster7屬氨氧化細(xì)菌，意味著在設(shè)施栽培與施肥條件下土壤中氨氧化細(xì)菌的種類(lèi)可能比大田更豐富。（2）施肥對(duì)土壤中Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b的豐度和相對(duì)百分比具有顯著影響。相關(guān)分析結(jié)果表明，有機(jī)質(zhì)含量和pH值均是導(dǎo)致氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，施肥是導(dǎo)致氨氧化細(xì)菌豐度差異的主要原因。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展氨氧化細(xì)菌參與的設(shè)施菜地氮素循環(huán)與轉(zhuǎn)化研究，制定設(shè)施菜地合理施肥量等，均具有重要的參考意義。