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本文作者：任佐華、毛瑩、虞選杰、李媛、劉二明單位：湖南農(nóng)業(yè)大學生物安全科學技術(shù)學院

脂肪酸是細胞壁和生物膜的重要組成成分,生物膜是生物體能感受外界環(huán)境因素變化的受體,生物膜上的生理、生化及物理性質(zhì)的改變最快最明顯的反應了環(huán)境對生物的影響[1],不同種類脂肪酸組成和含量的變化與生物的抗逆性有密切關(guān)系[2]。脂肪酸根據(jù)其飽和度不同,可分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸又可分為一價不飽和脂肪酸如油酸,棕櫚油酸等,和多價不飽和脂肪酸如亞油酸、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等[3]。多價不飽和脂肪酸是生物膜的重要組成成分,可以調(diào)節(jié)動態(tài)平衡、細胞構(gòu)型、細胞膜的滲透性;具有調(diào)節(jié)某些基因表達的作用,如調(diào)節(jié)編碼脂肪酸合成酶;同時還可以參與膜相關(guān)的生理過程,如細胞識別、脂代謝、免疫調(diào)節(jié)等[4],此外,還可用作食品添加劑、營養(yǎng)配方、健康輔料以及保健品等[5]。研究還表明微生物細胞脂肪酸的種類與數(shù)量構(gòu)成與微生物的分子特征、遺傳變異、致病性及其耐藥性有密切的關(guān)系[6]。稻曲病是由真菌稻綠核菌[Ustilaginoideavirens(Cooke)Takahashi]引起的水稻穗部重要病害[7]。稻曲病以菌核或厚垣孢子的形式越冬,水稻病粒上的稻曲球外圍的厚垣孢子,在病情發(fā)展過程中厚垣孢子漸漸由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色:黑色為休眠型、黃色為非休眠型,綠色為休眠與非休眠過渡態(tài)[8]。在真菌脂肪酸研究中,戴傳超通過研究環(huán)境因子對烏柏內(nèi)生真菌生長及脂肪酸的影響發(fā)現(xiàn)在內(nèi)生菌生長受到抑制的情況下,其脂肪酸不飽和指數(shù)增加[9]。陸合等研究逆境對真菌膜脂肪酸成分的影響時發(fā)現(xiàn)不同逆境脅迫條件下,真菌中膜的脂肪酸含量不一樣[10]。黃大慶通過檢測球孢白僵菌脂肪酸種類和含量,揭示了脂肪酸與毒力存在的相關(guān)性[11]。然而,稻曲病厚垣孢子在不同顏色轉(zhuǎn)變過程中,休眠型與非休眠型的厚垣孢子脂肪酸的組成和含量有何變化,迄今還未見報道,本文為了揭示稻曲病菌厚垣孢子的內(nèi)源性休眠機制,運用氣相色譜檢測了不同顏色厚垣孢子脂肪酸的組成和含量。

1材料與方法

1.1實驗材料2009年9月于懷化市洪江市灣溪鄉(xiāng)和豐村采集水稻品種兩優(yōu)396上的典型黃色、黃綠色和黑色稻曲病菌厚垣孢子,40°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。脂肪酸標準品SupelcoTM37ComponentfattyacidmethylestermixturecatalogNO.47885-U購買于Sigma公司,其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2破壁與厚垣孢子壁的提取3種不同顏色稻曲病菌厚垣孢子粉各稱取1000mg,分別采用液氮研磨-超聲破處理方法破壁[9],15000r/min離心5min,將上清液和沉淀分別0.1Pa、50°C真空干燥24h[12]。

1.3脂肪酸的提取1.3.1酸熱法:稱取450mg破壁后的厚垣孢子壁,加入6mL4mol/L的HCl振蕩2min,室溫放置30min,沸水浴3min,20°C速冷,加入12mL氯仿:甲醇(1:1,V/V)提取液,振蕩5min,10000r/min離心5min,取氯仿層,加入12mL0.1%NaCl溶液,混勻,10000r/min離心5min,取氯仿層揮發(fā)除去氯仿即得油脂[13]。

1.3.2索氏提取法:稱取450mg破壁后的厚垣孢子壁,用濾紙包裹后裝入索氏提取器,石油醚加熱回流提取6h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚即得油脂[13]。1.3.3有機溶劑法:稱取450mg破壁后的厚垣孢子壁,加入3mL氯仿:甲醇(1:2,V/V)提取液,振蕩2min,再加入1mL氯仿,振蕩5min,再加入5mL水,振蕩5min后10000r/min離心5min,取氯仿層,加入4mL0.1%NaCl溶液,混勻,10000r/min離心5min,取氯仿層,揮發(fā)去除氯仿即得油脂[13]。

1.4脂肪酸甲酯化稱取20mg粗脂置于試管中,加入1mL1mol/LKOH-甲醇溶液,在40°C水浴中反復振搖30min,靜置15min,置入70°C水浴中將其蒸干,加入2mL5％H2SO4甲醇溶液,在70°C水浴中振搖6min,加入2mL正己烷,靜置10min,取上清液,加入少許無水硫酸鈉[12]。

1.5粗脂提取率測定孢壁粗脂提取率=(b/a)×100%a:干燥孢壁重450mg;b:450mg厚垣孢子壁中的粗脂含量(mg)。孢壁內(nèi)粗脂提取率=(c/t)×100%c:上清液中粗脂含量(mg);t:1000mg厚垣孢子粉(mg)。1.6脂肪酸的種類及其含量測定采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法[12]。氣相色譜條件:Agient氣相色譜儀;HP-5毛細管柱(30.0m×0.32mm×0.25μm);進樣口溫度:250°C;FID溫度:280°C;柱溫:初始溫度110°C,15°C/min升溫至230°C,保持40min;線速度:33cm/s;分流比:5:1,H230mL/min、N230mL/s,尾吹30mL/min、air30mL/min、進樣量:1μL。

2結(jié)果

2.1不同提取脂肪酸的方法比較有機溶劑法與酸熱法相比較操作更為簡單,但提取得到的兩種形態(tài)厚垣孢子的飽和脂肪酸含量以及不飽和脂肪酸的含量均低于酸熱法;索氏提取法操作耗時較長,黑色厚垣孢子不飽和脂肪酸的提取含量均低于其它兩種方法(表1)。在3種方法中,以酸熱法提取最佳。

2.2不同顏色厚垣孢子粗脂提取率用酸熱提取方法測定3種不同顏色厚垣孢子壁和細胞總脂肪酸組成與含量。因為要測定整個厚垣孢子的脂肪酸的組成及其含量,離心后沉淀中的主要成分是厚垣孢子壁的提取物,而離心后的上清液中還含有厚垣孢子壁的內(nèi)容物,所以對離心后上清液的脂肪酸含量一并進行測定。不同顏色厚垣孢子的脂肪酸含量不同,即得到的粗脂含量也有差異,其平均粗脂提取率:黃色厚垣孢﹥﹥子黃綠色厚垣孢子黑色厚垣孢子(表2)。

2.3不同顏色厚垣孢子脂肪酸的組成及其含量差異比較以優(yōu)選的酸熱法提取脂肪酸測定出:黃色厚垣孢子壁有20種脂肪酸,飽和脂肪酸有9種,不飽和脂肪酸有11種,其中主要成分是十八油酸、亞麻油酸,分別占總脂肪的25.24%、27.38%。整個黃色厚垣孢子有20種脂肪酸,飽和脂肪酸有9種,不飽和脂肪酸有11種(表3)。黃色厚垣孢子壁飽和脂肪酸相對含量26.92%,不飽和脂肪酸相對含量60.46%;黃色厚垣孢子飽和脂肪酸相對含量28.87%,黃色厚垣孢子不飽和脂肪酸相對含量55.43%(表4)。黃綠色厚垣孢子壁有19種脂肪酸,飽和脂肪酸有9種,不飽和脂肪酸有10種,其中主要成分是:十八油酸、亞麻油酸酯,分別占總脂肪26.71%、25.26%。黃綠色厚垣孢子有19種脂肪酸,飽和脂肪酸有9種,不飽和脂肪酸有10種(表3)。黃綠色厚垣孢子壁的飽和脂肪酸相對含量17.23%,不飽和脂肪酸相對含量61.52%;厚垣孢子飽和脂肪酸相對含量21.00%,不飽和脂肪相對含量55.87%(表4)。黑色厚垣孢子壁有20種脂肪酸,飽和脂肪酸有9種,不飽和脂肪酸有11種,其中主要成分是十八油酸、亞麻油酸,分別占總脂肪的25.67%、20.78%。黑色厚垣孢子有22種脂肪酸,飽和脂肪酸有11種(表3)。厚垣孢子壁飽和脂肪酸相對含量是23.71%,不飽和脂肪酸相對含量70.64%;厚垣孢子飽和脂肪酸相對含量24.04%,不飽和脂肪酸相對含量63.89%。不飽和脂肪酸有11種,其中飽和脂肪酸十三酸、二十三酸是黑色厚垣孢子內(nèi)容物所特有的脂肪酸(表4)。各種顏色厚垣孢子均不含飽和脂肪酸C6、C8、C10、C11和不飽和脂肪酸順式-4,7,10,13,16,19二十二碳六烯酸(DHA)(表3)。

3討論

(1)在酸熱法、有機溶劑法、索氏提取法對稻曲病菌厚垣孢子壁脂肪酸進行的提取中,有機溶劑法較為簡單且易操作;酸熱法提取下,兩種形態(tài)厚垣孢子的飽和脂肪酸含量以及不飽和脂肪酸的含量均高于有機溶劑提取下的含量。其原因可能是有機溶劑未能有效的破壞脂肪酸與其它大分子物質(zhì)之間的共價鍵。索氏提取法是較為常見的方法,但其耗時較長,而且,黑色厚垣孢子不飽和脂肪酸的含量較之其它兩種方法低。酸熱法在有機溶劑法的基礎(chǔ)上加入沸水浴及速凍處理,使得脂肪酸與其它大分子物質(zhì)的共價鍵遭到破壞,因此,能檢測出更多的脂肪酸。(2)長鏈多不飽和脂肪酸是生物膜組成成分,起到維持細胞正常功能和增加機體抗逆性的作用[214]。不飽和脂肪酸例如十八油酸和亞麻油酸的含量在厚垣孢子顏色轉(zhuǎn)變的過程中逐漸增多,并且不飽和脂肪酸二十四碳烯酸只存在于黑色厚垣孢子壁中,推測原因可能是不飽和脂肪酸是細胞膜和線粒體膜的組成成分,而厚垣孢子在休眠過程中為了適應低溫環(huán)境,必須通過提高壁中脂肪酸的不飽和程度來增加孢子膜的流動性,進而保證整個孢子進行正常的生理活動。(3)在真菌中不飽和脂肪酸是以飽和脂肪酸硬脂酸為底物,經(jīng)碳鏈的延長和脫飽和2個反應而來[1516]。飽和脂肪酸硬脂酸在黃色厚垣孢子壁中的含量最多,黃綠色厚垣孢子壁中的含量較少,黑色厚垣孢子壁中的含量最少,原因可能是:1)黃色厚垣孢子萌發(fā)率較高,而萌發(fā)時在油脂的環(huán)境中,需要消耗能量[13];2)不飽和脂肪酸的產(chǎn)生對飽和脂肪酸產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié),從而導致飽和脂肪酸的含量逐漸降低[17]。(4)休眠型的黑色厚垣孢子與非休眠型的黃色厚垣孢子和介于休眠和非休眠中間型的黃綠色厚垣孢子相比,無論是孢子壁,還是孢子總的不飽和脂肪酸含量均含量最高;李博等人通過生長溫度對內(nèi)陸土壤冷適應細菌膜脂的脂肪酸組分影響研究發(fā)現(xiàn)一些嗜冷細菌可通過快速增加脂肪酸的不飽和度來適應低溫環(huán)境[18]。由此可推斷不飽和脂肪酸的含量提高,有利于厚垣孢子的休眠越冬。