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HSP70是HSP家族中最保守和最重要的一類應(yīng)激蛋白，其自身表達(dá)水平與生物體受環(huán)境脅迫時(shí)細(xì)胞組織損傷及自身防御能力關(guān)系密切［9］．鈣網(wǎng)蛋白(calretuculin，CRT)是動(dòng)物和高等植物體內(nèi)普遍存在且高度保守的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，具有維系細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能［10］．ilerová等［11］首次克隆蚯蚓Eiseniafetida的CRT基因并鑒定其生物功能．親環(huán)素A(cyclophilinA，cyPA)作為一類具有肽基脯氨酸順?lè)串悩?gòu)酶活性的免疫親和素，主要參與免疫調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并發(fā)揮細(xì)胞因子的功能，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，且對(duì)生物體炎癥的發(fā)生、細(xì)胞凋亡等具有調(diào)控作用．翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織，被認(rèn)為是一個(gè)在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關(guān)蛋白，而后被發(fā)現(xiàn)是一種普遍存在并且大量表達(dá)的蛋白，在進(jìn)化上高度保守，主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡具有雙重作用．目前，關(guān)于外源污染物暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達(dá)的研究還較為缺乏．鑒于污染物與生物體之間的相互作用始于分子水平［12，13］，因此，有必要開(kāi)展分子水平上多環(huán)麝香土壤污染脅迫蚯蚓特異性蛋白基因響應(yīng)表達(dá)的研究．本研究以蚯蚓HSP70、CRT、cyPA、TCTP等脅迫蛋白類基因?yàn)橹饕獙?duì)象，通過(guò)檢測(cè)分析低劑量AHTN或HHCB長(zhǎng)期暴露脅迫下各特異性蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量，以期篩選出敏感的分子生物標(biāo)志物，應(yīng)用于多環(huán)麝香污染土壤中亞急性毒性效應(yīng)的早期分子診斷和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中．

1材料與方法

1.1供試污染物和供試動(dòng)物吐納麝香(7-乙?；?1，1，3，4，4，6-六甲基-1，2，3，4-四氫萘，AHTN)購(gòu)自上海力智生化科技有限公司，純度99%;佳樂(lè)麝香(1，3，4，6，7，8-六氫-4，6，6，7，8，8-六甲基環(huán)五-γ-2-苯并吡喃，HHCB)購(gòu)自天津中科健化工有限公司，純度99%．毒理實(shí)驗(yàn)中采用的蚯蚓為赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)，是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)毒理試驗(yàn)?zāi)Ｊ缴镏唬?gòu)自南開(kāi)大學(xué)教研基地天津蘆臺(tái)賈立明蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)．選擇2～3個(gè)月齡、有明顯生殖環(huán)帶、體重為400～450mg的已篩選馴化后的成年蚯蚓作為供試受體生物．

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蚯蚓特異性蛋白基因mRNA表達(dá)的RT-qPCR檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)Trizol法提取蚯蚓總RNA［14］．取1μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶ReverTraAce-a-(Toyobo，日本)合成cDNA．根據(jù)GenBank已發(fā)表的蚯蚓HSP70、CRT、TCTP、cyPA等基因cDNA序列信息，采用PrimerExpress3.0設(shè)計(jì)RT-qPCR擴(kuò)增引物(表1)．RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL，其中SYBRGreenⅠMix(Bio-rad，美國(guó))10μL，ddH2O6.4μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各0.8μL，cDNA2.0μL．反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min，45個(gè)循環(huán)(95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸采集熒光信號(hào)30s)．PCR反應(yīng)結(jié)束后熔解曲線分析:95℃1min;60℃1min，60℃30s后，溫度0.5℃•s－1遞升至95℃結(jié)束．PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接轉(zhuǎn)化、克隆篩選等操作步驟，任選3個(gè)重組質(zhì)粒由北京華大基因公司測(cè)序．采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BlastX程序?qū)⒐┰嚮蚺c已發(fā)表基因間序列進(jìn)行同源性比較．

1.2.2AHTN或HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達(dá)供試自然土壤取自天津塘沽森林公園，為未受工農(nóng)業(yè)污染的潔凈表層土壤(0～20cm)，風(fēng)干后過(guò)2mm篩待用，土壤理化性狀、污染物土壤背景值以及土壤染毒與配制具體方法見(jiàn)筆者前期研究［7］．根據(jù)AHTN與HHCB土壤亞急性毒性的效應(yīng)濃度［7］，土壤長(zhǎng)期暴露實(shí)驗(yàn)染毒濃度設(shè)置5個(gè)梯度水平，分別為3、10、30、50和100μg•g－1．早期研究表明［17］，丙酮經(jīng)過(guò)充分揮發(fā)后對(duì)蚯蚓幾乎無(wú)毒性影響，而且去離子水與丙酮對(duì)照組中基因表達(dá)水平無(wú)差異變化，因此，本研究?jī)H設(shè)置丙酮試劑空白作為對(duì)照組．每個(gè)濃度處理組與對(duì)照組均設(shè)置4個(gè)平行．暴露28d結(jié)束后，分別于各處理組中任意挑選4條蚯蚓，即每條蚯蚓作為一個(gè)待測(cè)樣品，重復(fù)4次，進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析．1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析以β-actin作為持家基因，對(duì)各供試目的基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)的方式表示．?dāng)?shù)理統(tǒng)計(jì)均采用SPSS13.0軟件包分析．不同處理組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較采用Duncan法，顯著性差異水平為P＜0.05。

2結(jié)果與分析

2.1蚯蚓總RNA的純度與完整度由圖1可見(jiàn)，蚯蚓總RNA完整性較好，其28S與18S條帶清晰;并且RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之間，表明抽提的總RNA純度較高．因此，Trizol法提取RNA可滿足cDNA合成和RT-qPCR反應(yīng)需求．

2.2RT-qPCR引物設(shè)計(jì)合理性的驗(yàn)證通過(guò)測(cè)序比對(duì)結(jié)果可知(表2)，供試基因分別與已收錄的HSP70、CRT、cyPA和TCTP基因序列信息高度相似，表明RT-qPCR引物的設(shè)計(jì)可滿足目的供試基因片段擴(kuò)增檢測(cè)要求．各供試基因的熔解曲線皆為特異的單個(gè)峰(圖2)，沒(méi)有出現(xiàn)引物二聚體與非特異性擴(kuò)增，更加說(shuō)明本研究引物設(shè)計(jì)以及RT-qPCR反應(yīng)體系條件的建立適用于供試基因的特異性檢測(cè)．

2.3AHTN、HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因mRNA的響應(yīng)表達(dá)暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓各目的基因HSP70、CRT、cyPA和TCTPmRNA表達(dá)變化趨勢(shì)如圖3所示．當(dāng)蚯蚓暴露于較低染毒劑量的AHTN(3μg•g－1和10μg•g－1)或HHCB(3、10和30μg•g－1)處理組時(shí)，其HSP70基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化;而暴露于較高濃度AHTN(30、50和100μg•g－1)或HHCB(50μg•g－1和100μg•g－1)處理組時(shí)，HSP70基因表達(dá)水平分別較對(duì)照組水平顯著下調(diào)(P＜0.05)．總體而言，AHTN或HHCB長(zhǎng)期污染對(duì)HSP70基因表達(dá)水平均有顯著下調(diào)抑制作用(P＜0.01)．且HSP70基因表達(dá)水平與AHTN或HHCB暴露濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(AHTN:r=－0.829;HHCB:r=－0.717，P＜0.01)．當(dāng)蚯蚓暴露于3、10、50和100μg•g－1的AHTN污染土壤28d后，CRT基因表達(dá)量較對(duì)照組均顯著性上調(diào)(P＜0.05)，分別為對(duì)照組水平的2.2、1.8、5.0和2.0倍．10、30、50和100μg•g－1HHCB暴露處理組中的CRT基因表達(dá)水平也均顯著性上調(diào)(P＜0.05)，分別為對(duì)照組的2.9、3.2、1.8和2.3倍．與對(duì)照組相比較，蚯蚓暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，各濃度處理組的cyPA和TCTP基因表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)．

3討論

目前，由于暫時(shí)無(wú)法完全獲知污染物脅迫毒性作用的早期反應(yīng)及真正靶位，于是難以對(duì)污染物的環(huán)境暴露水平與生態(tài)毒性效應(yīng)給予準(zhǔn)確、及時(shí)的預(yù)測(cè)評(píng)估，而以特定污染物所致生物體表達(dá)譜(基因或蛋白質(zhì)水平表達(dá))的改變作為污染物專一暴露的分子生物標(biāo)記物，可以更加靈敏準(zhǔn)確地對(duì)環(huán)境中一些持久性有機(jī)污染物的生態(tài)安全性做出早期預(yù)警和監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)［19］．本研究發(fā)現(xiàn)暴露于高濃度AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓HSP70基因表達(dá)水平受到顯著抑制;與之前濾紙急性毒性試驗(yàn)結(jié)果相一致，高濃度AHTN或HHCB濾紙接觸染毒48h后，蚯蚓HSP70基因下調(diào)表達(dá)，主要是由活性氧自由基引起的氧化應(yīng)激水平所誘導(dǎo)［17］．此外，在某些水生毒理學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)HSP70下調(diào)表達(dá)的現(xiàn)象．Lee等［20］研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳、殺螟硫磷、壬基苯酚等污染物可抑制水生生物搖蚊幼蟲(chóng)Chironomustentans的HSP70基因表達(dá)．Rhee等發(fā)現(xiàn)壬基酚、辛基酚等脅迫下HSP70基因表達(dá)表現(xiàn)為下調(diào)抑制，而雙酚A暴露則會(huì)誘導(dǎo)HSP70基因上調(diào)表達(dá)，認(rèn)為其原因是不同種類分泌干擾物暴露脅迫對(duì)HSP70基因表達(dá)方式可能存在差異［21］．蚯蚓CRT基因表達(dá)水平在AHTN或HHCB土壤污染脅迫下表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)上調(diào)，其原因可能是CRT為了行使“分子伴侶”的生理功能或維系機(jī)體內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡而激發(fā)誘導(dǎo)CRT基因表達(dá)［22］．CRT基因的上調(diào)表達(dá)也是生物體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激壓力的響應(yīng)方式，是為了防御或降低細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)．多環(huán)麝香污染脅迫引起的蚯蚓體內(nèi)活性氧自由基累積，可以起脂質(zhì)過(guò)氧化并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，從而誘導(dǎo)蚯蚓機(jī)體內(nèi)Ca2+水平的迅速提升，而CRT作為Ca2+的調(diào)控基因則表現(xiàn)位持續(xù)的上調(diào)表達(dá)［23］．不同種類外源污染物暴露脅迫對(duì)cyPA基因表達(dá)方式并沒(méi)有表現(xiàn)出一定的規(guī)律．Stürzenbaum等［24］研究發(fā)現(xiàn)暴露于Cd、Pb、Zn、Cu等混合重金屬污染土壤6周后，蚯蚓L．rubellus的cyPA基因表達(dá)水平顯著增加;而B(niǎo)rulle等［16］研究認(rèn)為Cd土壤暴露6d后，蚯蚓E．fetida的cyPA基因表達(dá)卻被抑制顯著下調(diào)．本研究結(jié)果顯示AHTN和HHCB長(zhǎng)期(28d)污染暴露對(duì)蚯蚓cyPA基因表達(dá)無(wú)顯著性影響．因此，cyPA基因尚且不具備作為分子生物標(biāo)志物的特征，不適合用于多環(huán)麝香生態(tài)毒理效應(yīng)的分子診斷．Api等［25］早期研究認(rèn)為，多環(huán)麝香AHTN或HHCB不具備遺傳毒性致癌物的一些基本特性．本研究也發(fā)現(xiàn)，在AHTN或HHCB污染土壤長(zhǎng)期暴露下，蚯蚓翻譯控制腫瘤蛋白基因(TCTP)的表達(dá)水平無(wú)顯著性變化差異，從側(cè)面說(shuō)明了AHTN或HHCB沒(méi)有顯現(xiàn)可能致癌的特性．

綜上分析，HSP70mRNA水平下調(diào)與CRTmRNA水平上調(diào)的響應(yīng)表達(dá)是為了保護(hù)蚯蚓抵御自由基氧化應(yīng)激損傷，兩基因有望成為表征多環(huán)麝香土壤污染暴露水平及生態(tài)毒理效應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物．考慮到分子毒理學(xué)研究中蚯蚓基因數(shù)據(jù)庫(kù)信息相對(duì)較少，對(duì)于具備潛在分子生物標(biāo)志物特征的特異性基因，還需要開(kāi)展cDNA全序列克隆及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，為豐富蚯蚓基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)和構(gòu)建蚯蚓基因芯片檢測(cè)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而更有利于拓展多環(huán)麝香污染脅迫下高通量基因表達(dá)譜的研究．今后，還必須從生態(tài)毒理基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)角度，綜合分析多環(huán)麝香污染物脅迫下蚯蚓特異性基因表達(dá)與調(diào)控的變化，揭示多環(huán)麝香的毒理機(jī)制與毒性作用靶位，從而構(gòu)建多環(huán)麝香土壤污染早期預(yù)警的蚯蚓分子診斷技術(shù)體系．

4結(jié)論

(1)RT-qPCR引物的設(shè)計(jì)以及PCR反應(yīng)體系條件的建立適用于各供試基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的特異性檢測(cè)．(2)AHTN或HHCB土壤污染暴露脅迫下，蚯蚓HSP70基因表達(dá)水平受到顯著抑制，而CRT基因表達(dá)水平顯著誘導(dǎo)上調(diào);cyPA和TCTP基因表達(dá)水平均無(wú)顯著性變化．(3)HSP70與CRT兩基因?qū)⒂锌赡茏鳛闈撛谏飿?biāo)志物，可應(yīng)用于預(yù)測(cè)和評(píng)估土壤多環(huán)麝香污染水平及生態(tài)毒性效應(yīng)．

作者：陳春劉瀟威鄭順安周啟星李松單位：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所農(nóng)業(yè)部產(chǎn)地環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室南開(kāi)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境污染過(guò)程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)石油冀東油田公司油氣集輸公司