前言：本站為你精心整理了少兒AL基因表達(dá)研究范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價(jià)值，我們的客服老師可以幫助你提供個(gè)性化的參考范文，歡迎咨詢(xún)。

本文作者：趙曉莉潘凱麗錢(qián)新宏李迎俠杜莉王英娟羅建峰張垚強(qiáng)歡作者單位：第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科

分組：(1)alL組32例，男23例，女9例，年齡1．7～14歲，中位年齡4歲。低危10例，中危14例，高危8例。其中B-ALL26例，T-ALL6例。(2)AML組15例，男8例，女7例，年齡2．5～9歲，中位年齡5歲。其中M26例，M35例，M53例，M71例。(3)對(duì)照組20例，男12例，女8例，年齡4個(gè)月至14歲，中位年齡4歲。其中非惡性血液病骨髓標(biāo)本5例，門(mén)診體檢正常兒童外周血標(biāo)本15例。樣本的采集均征得患兒家長(zhǎng)或患兒本人同意。

免疫分型及融合基因檢測(cè)：所有AL患兒均在初發(fā)時(shí)采集骨髓液1～1．5mL，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫分型，根據(jù)白血病細(xì)胞表面抗原表達(dá)類(lèi)別分為T(mén)-ALL、B-ALL、AML;采集骨髓液3mL進(jìn)行BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測(cè)，所有AL患兒BCR/ABL融合基因及染色體(9，22)異位的檢測(cè)呈陰性。

儀器及試劑：基因擴(kuò)增儀MiniCyclerTM購(gòu)自MJRESEARCH公司;JS-380全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀購(gòu)自上海培清科技有限公司。Trizol總RNA提取試劑，cDNA第一鏈合成試劑盒，2×TaqPCRMasterMix均購(gòu)自TIANGENBIOTECH公司。

方法：

（1）提取單個(gè)核細(xì)胞。用常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離患兒或?qū)φ战M骨髓或外周血的單個(gè)核細(xì)胞，－80℃冰箱凍存，用于總RNA的提取。

（2）RNA提取及定量。取出－80℃冰箱凍存有單個(gè)核細(xì)胞的EP管，室溫自然解凍后，加入1mLTrizol，用漩渦振蕩器充分振蕩混勻，室溫放置5min;每使用1mLTrizol加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min;4℃12000轉(zhuǎn)/分(rpm)離心10min，把水相約600μL轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置30min;4℃12000rpm離心10min，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀;加入1mL4℃冰箱預(yù)冷的由DEPC稀釋的75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃5000rpm離心3min，小心倒出液體，室溫放置晾干(約1～2min)，加入30μLRNase-freeddH2O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。取1μL總RNA溶液用RNase-freeddH2O稀釋到100倍，用紫外分光光度儀測(cè)定總RNA的量，OD260的值在0．1～1．0之間，OD260/280的比值在1．7～2．0之間;取4μL制備好的RNA，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，結(jié)果有28s、18s、5s三條帶。

（3）cDNA的合成。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體積為50μL:標(biāo)本總RNA2μL，隨機(jī)引物2μL，dNTP2μL，補(bǔ)RNase-freeddH2O定容至14．5μL;70℃加熱5min，迅速在冰上冷卻2min;加入4μL5×First-StrandBuffer，0．5μLRNasin，再加入1μLTIANScriptM-MLV，充分混勻;EP管置于25℃溫浴10min，42℃溫浴50min，95℃加熱5min終止反應(yīng);置冰上用RNase-freeddH2O將反應(yīng)體系稀釋至50μL，－80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

（4）引物合成。Notch1和Jagged1基因引物及內(nèi)參照β-actin基因引物由北京Promega公司合成。見(jiàn)表1。

（5）二步法RT-PCR反應(yīng)液配制:反應(yīng)體系25μL，包括反轉(zhuǎn)錄的cDNA2～5μL，primer1(10μM)1μL，primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12．5μL，補(bǔ)RNase-freeddH2O至25μL。(2)反應(yīng)條件:Notch1:94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。Jagged1:95℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，65℃退火45s，72℃延伸45s，40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。β-actin:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。

（6）PCR產(chǎn)物分析。取PCR產(chǎn)物5μL，在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳(80v)，35min后紫外線(xiàn)拍照儀中讀取結(jié)果。采用RT-PCR檢測(cè)Notch1基因和Jagged1基因表達(dá)的電泳結(jié)果，以同時(shí)出現(xiàn)目的基因及β-actin基因電泳條帶時(shí)，判斷該標(biāo)本Notch1基因(或Jagged1基因)表達(dá)陽(yáng)性。以β-actin作為內(nèi)參照基因，應(yīng)用GlykoBandscanversion5．0凝膠圖像處理軟件，讀取Notch1/β-actin、Jagged1/β-actin灰度值比值進(jìn)行半定量檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)或百分率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法;多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1Notch1基因的表達(dá)情況

Notch1基因陽(yáng)性率:ALL組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);AML組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);ALL組與AML組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表2。Notch1基因表達(dá)水平:ALL組及AML組與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);ALL組與AML組比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表2，圖1。ALL組32例患兒中，Notch1基因陽(yáng)性23例。其中B-ALL組26例，陽(yáng)性17例(65%);T-ALL組6例，陽(yáng)性6例(100%)，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。T-ALL組與B-ALL組Notch1基因表達(dá)分別為1．42±0．58和0．71±0．27，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3．835，P=0．001)。

2Jagged1基因的表達(dá)情況

ALL、AML及對(duì)照組3組間Jagged1基因陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。ALL組及AML組Jagged1基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。ALL組與AML組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見(jiàn)表3，圖2。ALL組32例患兒中，Jagged1基因陽(yáng)性25例。其中B-ALL組26例，陽(yáng)性21例(81%);T-ALL組6例，陽(yáng)性4例(67%)，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。T-ALL組與B-ALL組Jagged1基因表達(dá)分別為0．72±0．29和0．70±0．31，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．127，P＞0．05)。

3Notch1和Jagged1基因在骨髓及外周血中的表達(dá)水平比較

在發(fā)病初期同時(shí)收集骨髓及外周血的9例患兒，進(jìn)行骨髓和外周血中基因表達(dá)水平的半定量比較。Notch1基因在骨髓和外周血中的平均表達(dá)水平分別為0．79±0．24和0．77±0．23，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．1460，P＞0．05)。Jagged1基因在骨髓和外周血中的平均表達(dá)水平分別為0．75±0．19和0．74±0．20，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．1140，P＞0．05)。

4Notch1與ALL臨床分型的關(guān)系

32例ALL患兒中，低危組Notch1陽(yáng)性表達(dá)率為50%(5/10)，中危組為71%(10/14)，高危組為88%(7/8)。不同臨床分型的3組間Notch1基因陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，該基因的部分功能缺失導(dǎo)致果蠅出現(xiàn)翅緣缺刻(Notch)。在脊椎動(dòng)物中，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)Notch同源體，Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。在哺乳動(dòng)物中有5種Notch配體，Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1和Jagged2。Mummery-Widmer等［6］研究發(fā)現(xiàn)了參與非對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂的6個(gè)新基因及調(diào)控Notch信號(hào)通道的23個(gè)新基因。Notch信號(hào)通路是進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡的功能，幾乎涉及所有的組織和器官。在血液系統(tǒng)中，Notch受體及其配體在造血細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中具有極為重要的作用。Notch還可促使造血干細(xì)胞向T細(xì)胞方向分化，并促進(jìn)外周T細(xì)胞和脾邊緣區(qū)B細(xì)胞的分化與成熟［7］。Notch信號(hào)在人類(lèi)各種腫瘤中廣泛表達(dá)。在腫瘤發(fā)生的過(guò)程中，Notch受體可能扮演致癌基因與抑癌基因的雙重角色，這與組織類(lèi)型、腫瘤發(fā)展階段及Notch信號(hào)強(qiáng)度有關(guān)。

Notch信號(hào)通路與惡性腫瘤的關(guān)系最早在人類(lèi)T-ALL中被發(fā)現(xiàn)［2］。在T-ALL中，普遍存在Notch信號(hào)的活化和Notch基因的高表達(dá)。Notch1～4的失調(diào)均與T淋巴細(xì)胞惡性疾患有關(guān)。Chiaramonte等［8］通過(guò)對(duì)34例白血病患者的外周血和25個(gè)白血病/淋巴瘤細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞惡性腫瘤幾乎都有Notch信號(hào)通路的活化。本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在兒童不同類(lèi)型AL中的異常表達(dá)有明顯差異，T-ALL發(fā)病與異常的Notch1信號(hào)通路有關(guān)。與正常對(duì)照相比，在ALL及AML患兒中，Notch1陽(yáng)性表達(dá)率增高，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ALL和AML比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Notch1信號(hào)可能在AML中也起著重要作用。王冠玲等［9］應(yīng)用免疫組化的方法研究了11例AML患兒，發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，考慮Notch1信號(hào)可能在粒系來(lái)源的髓性白血病中也起著重要作用。

Notch信號(hào)與B淋巴細(xì)胞惡性疾患密切相關(guān)。Jundt等［10］在霍奇金病的惡性B細(xì)胞中檢測(cè)到Notch1受體高表達(dá)，與配體結(jié)合后，Notch1信號(hào)通路激活，促進(jìn)轉(zhuǎn)化B細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制亞砷酸導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Wickremasinghe等［11］最近發(fā)現(xiàn)，Notch高表達(dá)可以抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而阻斷Notch信號(hào)后，p53表達(dá)水平升高并啟動(dòng)凋亡程序促使腫瘤消退。本研究對(duì)表達(dá)陽(yáng)性的患兒進(jìn)行半定量分析，Notch1在T-ALL中明顯高表達(dá)，而在B-ALL中表達(dá)水平較低，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6例T-ALLNotch1基因全部表達(dá)陽(yáng)性，而26例B-ALL中17例表達(dá)陽(yáng)性，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與T-ALL病例數(shù)偏少有關(guān)。

AML源自造血祖細(xì)胞的失調(diào)，其特征為過(guò)度的自我更新和分化受阻。Tohda等［12］報(bào)道AML細(xì)胞系及病人AML細(xì)胞均有Notch1表達(dá)，因此研究推測(cè)Notch信號(hào)可能與AML細(xì)胞的異常生長(zhǎng)有關(guān)，但進(jìn)一步的研究卻不支持該假設(shè)。Tohda等［13］檢測(cè)了人類(lèi)重組Notch配體Jag-ged1及Delta1對(duì)原發(fā)AML細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響，結(jié)果顯示對(duì)短期生長(zhǎng)的影響有3種:促進(jìn)、抑制和無(wú)顯著影響，而自我更新能力受到抑制或無(wú)顯著影響。本研究對(duì)47例AL兒童中ALL組、AML組、對(duì)照組Jagged1陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chiaramonte等［14］研究發(fā)現(xiàn)Jag-ged1在B-ALL、T-ALL、AML表達(dá)水平依次增高。周亞南等［15］報(bào)道，Jagged1表達(dá)趨勢(shì)與Chiaramonte的研究一致但均低于正常供體。本研究驗(yàn)證了兩者的共同點(diǎn)，但本研究結(jié)果顯示，ALL、AML患兒Jag-ged1基因表達(dá)水平均比對(duì)照組高，而B(niǎo)-ALL組與T-ALL組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原發(fā)AML盡管Notch1信號(hào)活化水平較低，卻有著Jagged1的高水平表達(dá)，Jagged1可能本身十分重要，不一定要與Notch信號(hào)通路激活有關(guān)，在髓系白血病發(fā)病過(guò)程中可能存在Jagged1信號(hào)自主活動(dòng)。2009年，Tohda等［16］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在AML細(xì)胞系中，配體活化的Notch信號(hào)對(duì)不同的細(xì)胞存在不同的調(diào)控反應(yīng)，即活化的Notch通路促進(jìn)了TMD7細(xì)胞增殖，抑制了U937細(xì)胞的分化及凋亡，在OCI/AML-6和THP1細(xì)胞，Notch信號(hào)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)和自我更新，誘導(dǎo)細(xì)胞向類(lèi)巨噬細(xì)胞分化。

本研究對(duì)9例在發(fā)病初期同時(shí)采集外周血與骨髓標(biāo)本的初發(fā)AL兒童進(jìn)行Notch1及Jagged1mRNA半定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞中Notch1及Jagged1基因表達(dá)水平與骨髓液中單個(gè)核細(xì)胞中Notch1及Jagged1基因表達(dá)水平一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示可用外周血替代骨髓液進(jìn)行Notch1及Jagged1基因檢測(cè)，而且可以減少AL兒童因骨髓穿刺造成的身體及心理傷害。不同類(lèi)型ALL中的表達(dá)有明顯差異，T-ALL患兒中的Notch1表達(dá)明顯高于B-ALL患兒;在兒童AL細(xì)胞中，普遍存在Notch1信號(hào)的活化;Notch1在兒童AML中異常表達(dá)，提示Notch1在兒童AML中也起著重要作用。Jagged1在ALL及AML患兒中異常表達(dá)，還需要收集更多資料論證。