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本文作者：范維偉孫慧君蔡超俊袁瑋韓國柱作者單位：大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

實(shí)驗(yàn)部分

1外源性pcr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響

(1)動物分組、給藥及模型制備:小鼠60只，隨機(jī)分為對照組、PCr高劑量組(4．5g•kg－1)、PCr低劑量組(1．5g•kg－1)，每組20只。腹腔注射給藥，容量0．1mL•10g－1體重，對照組給予等容量NS。于給藥20min后用大組織剪沿小鼠雙耳連線下部快速斷頭，制備全腦永久性缺血模型。

(2)標(biāo)本處理及指標(biāo)測定:每組取10只于斷頭即刻記錄張口喘息持續(xù)時間。另10只于動物斷頭20s取大腦，一側(cè)半球制備10%腦組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定蛋白濃度(考馬斯亮藍(lán)法)、SOD活力(黃嘌呤氧化酶法)及MDA含量(TBA法)。另側(cè)腦半球經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)制備石蠟片HE染色。

2外源性PCr對小鼠全腦缺血再灌注損傷的影響

(1)實(shí)驗(yàn)分組、給藥及模型制備:小鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、PCr高劑量組(2．0g•kg－1)、低劑量組(1．0g•kg－1)組及尼莫地平(Nim)組，每組10只。NS及PGr分別以0．1mL•10g－1體重于首次缺血即刻1次尾靜脈注射，Nim組術(shù)前2d始灌胃給藥，2次/d，每次100mg•kg－1體重，手術(shù)當(dāng)天術(shù)前30min末次給藥。按文獻(xiàn)［2］方法，小鼠麻醉，雙側(cè)頸總動脈(CCA)完全阻斷血流10min，復(fù)灌10min，重復(fù)3次，制備全腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅暴露CCA，不進(jìn)行缺血再灌操作。不同處理組小鼠分別于末次再灌2h后斷頭取腦。

(2)標(biāo)本處理及指標(biāo)測定:每組取10只小鼠左側(cè)大腦測定腦組織含水量(干濕重法)腦含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100WesternBlot法測定CD14蛋白表達(dá):每組取6只小鼠右側(cè)大腦組織經(jīng)裂解液充分裂解后，4℃離心取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。12%SDS－PAGE分離膠，5%SDS－PAGE濃縮膠。樣品經(jīng)處理后上樣，電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜(恒流0．8mA/cm，室溫，48min)，5%脫脂奶粉封閉。Rabbitanti－RatCD14(1∶250)以及β－Actin抗體(1∶1000)孵育過夜(4℃)，二抗(1∶5000)37℃水浴孵育2h。ECL暗室顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照后Gel－ProAnalyzer4．0軟件分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn);多組間均數(shù)樣本比較采用One－ANVOA方差分析;兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0．05認(rèn)為差異有顯著性意義。

結(jié)果

1外源性PCr對小鼠全腦永久性缺血損傷的影響高劑量

PCr可延長小鼠永久性全腦缺血后張口喘息持續(xù)時間、增加腦組織中SOD活力，與對照組比較P＜0．05。高、低劑量組小鼠腦組織中MDA含量均明顯低于對照組(P＜0．05)，見表1。

2外源性PCr對小鼠GBI/R損傷的影響

(1)外源性PCr對腦含水量的影響:與假手術(shù)組比較，GBI/R模型組腦含水量升高明顯(P＜0．05);給予外源性PCr及Nim處理后腦含水量低于模型組，差異具有顯著性意義(P＜0．05)，見表2。

(2)外源性PCr對腦組織中CD14蛋白表達(dá)的影響:WesternBlot法檢測顯示小鼠GBI/R后腦組織CD14蛋白表達(dá)明顯升高。不同劑量PCr處理可明顯降低CD14升高的程度。見表2，圖1。

(3)對腦組織病理變化的影響:經(jīng)組織切片HE染色鏡下觀察，結(jié)果顯示假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，核大而圓無固縮，間質(zhì)均勻致密;模型組可見大量神經(jīng)細(xì)胞變性，胞核固縮、深染，細(xì)胞周圍間隙結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)大量空泡，PCr及Nim給藥組與模型組相比病變程度均明顯減輕。見圖2。

討論

急性腦缺血是臨床上常見的腦血管疾病之一，能量代謝障礙是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的觸發(fā)因素，有效提供能量是缺血早期治療，減輕組織損傷的關(guān)鍵。本研究所用小鼠腦缺血性損傷模型具有良好的重現(xiàn)性，損傷指標(biāo)明確。磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)是體內(nèi)高能磷酸化合物的儲存形式，其分子中含高能量的氨基磷酸鍵，在細(xì)胞中水解可產(chǎn)生超過12000kal/mol能量，是細(xì)胞的重要能源物質(zhì)［3］。在組織大量消耗ATP，導(dǎo)致ADP增多時，PCr可將其磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP以補(bǔ)充能量的供應(yīng)，在生理及應(yīng)激條件下通過此反應(yīng)維持機(jī)體能量代謝的動態(tài)平衡［4－5］同時具有穩(wěn)定磷脂膜、保護(hù)細(xì)胞免受自由基過氧化損害等作用［6］。近期有研究認(rèn)為，PCr的作用方式可能有以下兩方面:(1)通過PCr分子起作用，其含有的高能磷酸鍵參與能量代謝，使ATP生成增加;(2)通過其體內(nèi)代謝產(chǎn)物肌酸(creatine，Cr)發(fā)揮作用，在這種情況下，PCr作為Cr的一個前體藥物或載體而發(fā)揮作用［7］。腦缺血時可產(chǎn)生大量氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，引起細(xì)胞損傷。此過程生成的MDA等脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物亦可造成細(xì)胞損傷。SOD清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。將MDA與SOD配合測定，以反映機(jī)體氧化損傷和抗氧化能力是本類研究常用方法。諸多研究已證實(shí)，急性腦缺血時因中樞神經(jīng)功能障礙導(dǎo)致植物神經(jīng)功能紊亂，加之機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，細(xì)菌移位、大量內(nèi)毒素釋放并誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體(CD14)表達(dá)增多，參與并加重組織損傷，甚至觸發(fā)多器官功能障礙綜合征的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示外源性PCr可明顯延長全腦永久性缺血后張口呼吸時間;減輕腦水腫及損傷后腦組織形態(tài)學(xué)改變。顯示外源性PCr可有效緩解腦缺血性損傷，維持腦功能。而降低組織MDA含量、提高SOD活力;抑制損傷后CD14表達(dá)則提示PCr抗腦缺血性損傷作用可能通過增加供能、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)腺苷酸池，穩(wěn)定磷脂膜等機(jī)制，進(jìn)而提高組織抗氧化性損傷能力及降低繼發(fā)性內(nèi)毒素攻擊、保護(hù)細(xì)胞有關(guān)。本研究在一定程度上證實(shí)了在腦缺血早期給予外源性PCr可有效減輕腦組織缺血及缺血再灌注損傷，維持腦功能，并有可能減輕腦損傷繼發(fā)的其他組織器官損傷。為臨床用藥提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。