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本文作者：楊青青1,2李曉云2陳健2彭翼飛2馬文麗2鄭文嶺1,2作者單位：1上海大學(xué)生命科學(xué)院2南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所

stat6-ORF和STAT6-RNAi載體構(gòu)建成功

應(yīng)用高保真酶和自行設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示成功擴(kuò)增了STAT6基因ORF的全長(zhǎng)片段2544bp；測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的STAT6-ORF沒(méi)有發(fā)生突變（因序列過(guò)長(zhǎng)，本文未予列出）。將STAT6-ORF片段連接至pLVTHm載體后，通過(guò)ClaⅠ和MulⅠ雙酶切，獲得大小與STAT6-ORF相符的片段（約2500bp片段）（圖1A）；測(cè)序結(jié)果也顯示插入序列無(wú)堿基突變，表明成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pLVTHm-STAT6-ORF。采用化學(xué)合成方法合成STAT6-RNAi片段，將其連接至pLVTHm載體后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段無(wú)突變（圖1B），表明成功構(gòu)建抑制表達(dá)載體pLVTHm-STAT6-RNAi。

STAT6-ORF和STAT6-RNAi載體的慢病毒包裝及報(bào)告子的驗(yàn)證

分別將pLVTHm空表達(dá)載體、pLVTHm-STAT6-ORF過(guò)表達(dá)載體或pLVTHm-STAT6-RNAi抑制表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒psPAX2和PMD2.G共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，3個(gè)載體的感染效率均在80%以上（圖2）。收集病毒上清液進(jìn)行病毒顆粒濃縮，pLVTHm空病毒組、STAT6-ORF轉(zhuǎn)染組和STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染組慢病毒顆粒的病毒效價(jià)分別為3.0×107、2.7×107和4.1×107pfu/mL，證實(shí)這3個(gè)載體均可用于感染RKO細(xì)胞。

病毒感染RKO細(xì)胞后STAT6表達(dá)的變化

通過(guò)50μg/mLTET篩選及25μg/mLTET維持培養(yǎng)，獲得了感染STAT6-ORF或STAT6-RNAi慢病毒的RKO穩(wěn)定細(xì)胞株。RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，感染pLVTHm-STAT6-ORF或pLVTHm-STAT6-RNAi慢病毒載體的RKO細(xì)胞中STAT6mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高或降低。由此說(shuō)明，本研究成功獲得了STAT6過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)的RKO細(xì)胞（圖3）。

STAT6過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞增殖的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)組成型表達(dá)STAT6-ORF的RKO細(xì)胞增殖變化不明顯，但從第2代開(kāi)始，細(xì)胞增殖速度提高；轉(zhuǎn)染了pLVTHm-STAT6-RNAi的細(xì)胞增殖減緩，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及細(xì)胞的傳代（待RKO細(xì)胞傳至第3代時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞已死亡），細(xì)胞逐漸崩解，發(fā)生漂浮死亡（圖4A）。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與感染第1代（病毒感染細(xì)胞0h）的細(xì)胞活性相比，過(guò)表達(dá)STAT6-ORF的RKO細(xì)胞的活性增強(qiáng)并不明顯（F＝0.650，P＝0.609）；而轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi的RKO細(xì)胞的活性從第2代開(kāi)始下降，其第3代和第4代細(xì)胞的活性均顯著低于第1代（F＝290.114，P＜0.001）（圖4B）。

STAT6過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)對(duì)RKO細(xì)胞遷移的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，正常培養(yǎng)的RKO細(xì)胞具備遷移能力；當(dāng)過(guò)表達(dá)STAT6-ORF后，細(xì)胞遷移能力提高，尤其是轉(zhuǎn)染后48h時(shí)差異顯著（F＝573.568，P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi后，細(xì)胞遷移能力顯著下降（F＝103.274，P＜0.01）。

Jak-STAT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)除Ras-MAPK之外另一條重要的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路[5]，迄今為止已發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子STAT家族中的7個(gè)成員，包括STAT1、2、3、4、5a、5b和6[6]。轉(zhuǎn)錄因子STAT6可被IL-4和IL-13所激活，IL-4/IL-13介導(dǎo)重疊的生物功能，其膜受體有2種，一種是IL-4Rα，另一種是IL-13Rα1，后者為低親和結(jié)合受體[7-9]。在免疫細(xì)胞中，STAT6是IL-4介導(dǎo)輔助性T細(xì)胞2（helperTcell2，Th2）分化所必需的上游轉(zhuǎn)錄因子。IL-4可激活STAT6的表達(dá)，STAT6在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)磷酸化激活后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，結(jié)合特異啟動(dòng)子元件DNA位點(diǎn)（5’-TTCN4GAA-3’），繼而啟動(dòng)下游基因的表達(dá)[10-12]。STAT6啟動(dòng)的下游基因包括細(xì)胞膜表達(dá)分子CD23、MHCclassⅡ和IL-4Rα等[3,13]。同時(shí)，激活的STAT6還可下調(diào)炎性反應(yīng)因子IL-12和TNF-α等的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，STAT6基因敲除的Th2細(xì)胞與IL-4Rα缺失的Th2細(xì)胞具有相似的表型，即缺乏分化的Th2細(xì)胞[14,15]。在腫瘤細(xì)胞中，激活的STAT6具有抗腫瘤作用，如原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌荷瘤小鼠缺失STAT6可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃離免疫監(jiān)督[14,15]。然而，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)STAT6在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，包括前列腺瘤[16]、T細(xì)胞淋巴瘤[17]、霍奇金淋巴瘤[18]、結(jié)直腸癌[19]和原發(fā)性縱隔腔大B細(xì)胞淋巴瘤[20]。Li等[21]發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29可自發(fā)性表達(dá)Th2細(xì)胞因子基因（例如：IL-4、IL-13、GATA-3、CDK4、CD44v6和S100A4），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂和轉(zhuǎn)移，并拮抗腫瘤細(xì)胞的凋亡；而在人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco-2中，IL-4/STAT6信號(hào)通路失活，即IL-4不能激活STAT6，腫瘤細(xì)胞傾向于自發(fā)性表達(dá)Th1和Th17細(xì)胞因子基因（例如：IFNγ、TNFα、IL-12A、IL-17、IL-23、T-bet、CDKN1A、CDKNIB、CDKN2A和NM23-H1），可影響細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞遷移，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21,22]。上述研究結(jié)果表明，IL-4/STAT6信號(hào)通路基因激活與否與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究構(gòu)建了帶有GFP標(biāo)志的STAT6-ORF/STAT6-RNAi表達(dá)載體，并將其包裝成慢病毒顆粒，感染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株，結(jié)果表明成功構(gòu)建及包裝了STAT6-ORF和STAT6-RNAi的慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)病毒顆粒感染RKO細(xì)胞并獲得了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT6-ORF轉(zhuǎn)染的RKO細(xì)胞的增殖速度加快并不明顯（P＝0.609），但細(xì)胞遷移能力卻明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染的RKO細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.001），遷移能力也顯著減弱（P＜0.01）?？傊狙芯客ㄟ^(guò)STAT6基因過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)STAT6可能是促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的重要轉(zhuǎn)錄因子。在此基礎(chǔ)上，本課題組將進(jìn)一步探討STAT6促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制。