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本文作者：周永春王熙才陳艷金從國劉馨姚乾黃尤光陳曉群伍治平黃云超作者單位：昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所

實時熒光定量PCR擴增效率評價及實驗細胞株的篩選

本研究前期共提取了10株肺癌細胞及其相關細胞的總RNA，各組細胞總RNA的D260/D280均為1.9～2.1，提示RNA純度較高；1%RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測進一步發(fā)現(xiàn)其RNA完整性較好，適合作為RT-PCR模板。在RNA反轉錄后，取倍比稀釋的sox4和GAPDHcDNA進行實時熒光定量PCR擴增效率評價，結果顯示sox4和內參基因GAPDH的擴增曲線相關系數(shù)（R2）均大于0.99，符合使用2－ΔΔCt方法分析sox4mRNA相對表達量的前提條件。以人肺上皮細胞LEC作為校正，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，與肺腺癌細胞A549以及GLC、人胎肺細胞KMB-17、人肺腺癌細胞H157、個舊肺鱗癌細胞YTMLC、大細胞肺癌細胞H460和高轉移性大細胞肺癌細胞H460SM相比，宣威女性肺癌細胞XWLC-05中的sox4mRNA表達水平最高（圖1），因此選用該細胞進行后續(xù)實驗。

高干擾效果sox4-siRNA的篩選及其轉染細胞后sox4表達的變化

PCR檢測結果顯示，與空白對照組相比，轉染sox4-siRNA2的XWLC-05細胞中sox4mRNA的表達無明顯變化，而轉染sox4-siRNA1和sox4-siRNA3的XWLC-05細胞中sox4mRNA的表達水平明顯降低，其中sox4-siRNA3的抑制率最高（圖2A），因此選用sox4-siRNA3進行后續(xù)實驗。實時熒光定量PCR檢測sox4-siRNA3轉染XWLC-05細胞后24、48和72h時，sox4mRNA表達的變化。結果顯示，24h時，實驗組與空白對照組和陰性對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；48h和72h時，實驗組細胞中sox4mRNA的表達水平與陰性對照組和空白對照組相比均明顯降低（48h時的P值分別為0.000和0.001，72h時的P值分別為0.000和0.001），其中以轉染后48h時的抑制作用最為明顯（圖2B）?？瞻讓φ战M與陰性對照組轉染后48h和72h時的sox4mRNA表達水平無明顯差異（P值分別為0.815和0.506）。蛋白質印跡法檢測結果亦顯示，sox4-siRNA3轉染后24、48和72h時，實驗組細胞中sox4蛋白的相對表達水平分別為0.203±0.034、0.046±0.026和0.092±0.018。其中，24h時各組之間的sox4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；48h和72h時，實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，sox4蛋白表達水平明顯下降（48h時的P值分別為0.000和0.003，72h時的P值分別為0.044和0.031），其中以轉染后48h時的下降幅度最為明顯（圖2C）?？瞻讓φ战M和陰性對照組各時段sox4蛋白的表達無明顯差異（P值分別為0.111、0.077和0.101）。

抑制sox4表達對XWLC-05細胞增殖的影響

倒置顯微鏡下觀察實驗組、空白對照組和陰性對照組細胞均生長良好，呈均一透明的貼壁狀態(tài)，增殖速度、生長密度和大體形態(tài)無明顯差異（圖3A）。MTS法檢測結果（圖3B）顯示，轉染sox4-siRNA3的實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，細胞增殖無明顯差異（P值分別為0.059和0.113），空白對照組與陰性對照組之間的差異也無統(tǒng)計學意義（P＝0.650）。

抑制sox4表達對XWLC-05細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結果（圖3C～D）顯示，劃痕后培養(yǎng)48h時，各組細胞均向劃痕區(qū)遷移，轉染sox4-siRNA組細胞的遷移距離明顯短于空白對照組和陰性對照組（P值分別為0.000和0.023），空白對照組與陰性對照組之間的遷移距離差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.090）。Transwell侵襲實驗結果（圖3E～F）顯示，轉染sox4-siRNA后48h時，實驗組穿膜細胞數(shù)為（142.0±4.2）個，與空白對照組和陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P值均為0.000）；而空白對照組與陰性對照組穿膜細胞數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義[分別為（591.0±3.5）個和（559.0±4.9）個，P＝0.372）。實驗組穿膜細胞經(jīng)染色后，洗脫液的D值與陰性對照組和空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.000和0.001），而陰性對照組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.566）。上述結果表明，抑制sox4表達可顯著降低XWLC-05細胞的遷移和侵襲能力。

抑制sox4表達對XWLC-05細胞周期及凋亡的影響

FCM檢測結果顯示，轉染sox4-siRNA348h后，實驗組可見典型的DNA水平小于二倍體的亞G1凋亡峰，凋亡率為（29.12±5.37）%，較空白對照組細胞凋亡率[（0.46±1.33）%]和陰性對照組細胞凋亡率[（0.41±2.30）%]顯著升高（P值均為0.000，圖4），而實驗組PI與空白對照組和陰性對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.168和0.225，表3），空白對照組與陰性對照組之間的凋亡率和PI差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.733和0.992）。

云南省宣威地區(qū)女性高發(fā)肺癌，近年來受到國內外學者的廣泛關注。本院收治的宣威女性肺癌患者除表現(xiàn)為對常規(guī)放化療不敏感的共性外，還顯示出發(fā)病年齡年輕化、轉移早、對現(xiàn)有靶向治療不敏感和預后差的特點。作為轉錄因子，sox4除在人類胚胎的發(fā)育和分化中扮演重要角色以外[11]，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也具有重要作用。

在細胞嚴謹有序的分化和發(fā)育過程中，sox4基因的突變、缺失或過表達均可能導致細胞分化障礙以及增殖和凋亡失控，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。既往研究揭示，sox4在不同類型腫瘤中具有致癌基因的作用[12-15]，也可作為一種抑制因素影響腫瘤的生長[16,17]。這些作用機制涉及sox4對細胞信號通路的調節(jié)、對細胞凋亡的調控、對微小RNA（microRNA）的表達調控以及對細胞增殖和分化的調控等。在肺癌領域，目前的研究多集中于sox4表達差異及突變方面[10]，最近也有學者通過高通量芯片技術致力于探討受sox4調節(jié)的下游靶基因，并證實小細胞肺癌和非小細胞肺癌中均有sox4的過表達，受其影響的下游基因多達123個，且在不同類型的肺癌中存在差異[18]。

然而，目前尚不明確sox4在肺癌生長和轉移中的確切機制。本研究通過對10株不同類型肺癌細胞和正常細胞株進行比較，發(fā)現(xiàn)sox4mRNA在正常人支氣管上皮細胞BEAS-2B和人肺上皮細胞LEC中呈現(xiàn)低表達，而在胚胎細胞KMB-17中呈現(xiàn)高表達，符合其作為胚胎發(fā)育調節(jié)基因的本質。此外，與正常肺及支氣管細胞相比，sox4在各類型肺癌細胞中均表現(xiàn)為過表達，推測其與惡性腫瘤細胞去分化的特點有關。本實驗結果顯示，宣威女性肺癌細胞XWLC-05中的sox4mRNA表達水平相對較高，因此采用RNA干擾技術抑制該基因在XWLC-05細胞中的表達，試圖探討sox4在宣威肺癌侵襲和轉移中的作用。XWLC-05細胞系由昆明醫(yī)學院病理教研室于2007年建立，是目前唯一以宣威女性肺癌為來源建立的細胞株，材料取自宣威當?shù)匾幻?8歲的女性肺腺癌患者（右肺中分化腺癌）。實驗證明，該細胞株維持了原腫瘤的表型特征，能夠形成與宣威女性肺癌具有相同形態(tài)學特征的裸鼠移植瘤[19]。因此，選擇該細胞作為體外研究的對象，能夠最大程度地反映宣威女性肺癌的生物學特征。

為了避免只選擇一個序列可能出現(xiàn)RNA干擾無效或低效的情況，本研究選擇了sox4基因編碼序列中3個可能的干擾位點，并篩選出干擾效應最強的sox4-siRNA3進行實驗，同時通過設置陰性對照以排除可能出現(xiàn)的假陽性結果。實驗結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，sox4-siRNA能夠在mRNA和蛋白水平顯著降低腫瘤細胞中sox4的表達，且抑制效應在轉染后48h時最強，這與siRNA的瞬時干擾作用相符，因此后續(xù)實驗均選用轉染后48h時的細胞作為研究對象。

MTS法檢測細胞增殖活性的原理與傳統(tǒng)的MTT法相同，但因為前者不需要對細胞進行沖洗以及額外添加DMSO，也不需要收獲細胞，可直接進行比色，因此兼具了MTT法快速、安全和靈活的特點，同時操作更加簡便，敏感度更高，實驗結果也更加準確而可靠[20]。本研究利用MTS法檢測XWLC-05細胞轉染sox4-siRNA后的增殖活性，結果顯示與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，轉染前后顯微鏡下的細胞形態(tài)學也與空白對照組無明顯差異。FCM結果也顯示，實驗組和對照組細胞的增殖率無顯著差異，提示sox4可能并不參與調控XWLC-05細胞的增殖。不過，轉染48h后的FCM檢測結果卻提示，實驗組細胞出現(xiàn)了明顯的亞二倍體峰，其凋亡率較空白對照組和陰性對照組明顯升高，提示sox4可能在XWLC-05細胞的凋亡中起一定的作用，這與Liu等[12]在前列腺癌中的研究結果一致。

基膜是阻止腫瘤細胞侵襲和轉移的機械屏障，而Matrigel是從富含細胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出的基膜基質，主要成分包括層黏連蛋白、膠原Ⅳ、巢蛋白和硫酸肝素糖蛋白等，還包含生長因子和基質金屬蛋白酶等。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學活性的三維基質，可以模擬體內細胞基膜的結構、組成、物理特性和功能。本研究結果顯示，抑制sox4表達可以降低XWLC-05細胞對Matrigel的穿膜能力，同時劃痕實驗顯示細胞遷移率顯著降低，提示sox4與XWLC-05細胞的侵襲和轉移表型密切相關。結合FCM檢測結果，推測抑制細胞凋亡可能是sox4增強腫瘤細胞惡性行為的機制，但對其具體的分子機制仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究利用siRNA成功抑制了宣威女性XWLC-05肺癌細胞中sox4的表達。體外實驗證實，抑制sox4表達后腫瘤細胞的侵襲和轉移能力均下降，雖然細胞增殖未受到明顯影響，但細胞凋亡明顯增加。本研究結果為下一步構建穩(wěn)定轉染模型和動物實驗奠定了基礎，也為以sox4作為肺腺癌治療靶點的研究提供了實驗依據(jù)。