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【摘要】肝藥酶在藥物代謝中具有十分重要的作用。對肝藥酶的研究方法中，以動物肝臟或肝細胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建體外肝代謝系統(tǒng)是體外代謝研究中最重要的環(huán)節(jié)之一。對體外肝代謝的研究，主要是利用肝微粒體、基因重組CYP450酶系、肝細胞培養(yǎng)、肝組織切片及離體肝灌流系統(tǒng)等方法。本文綜述近年國內(nèi)外所應用的不同體外肝代謝系統(tǒng)，并對各體外代謝研究方法進行比較，指出根據(jù)各系統(tǒng)的特性、不同的實驗要求和目的，選擇適當?shù)难芯糠椒ǖ闹匾浴?/p>

【關(guān)鍵詞】細胞色素P450酶；肝微粒體；肝細胞培養(yǎng)；肝組織切片；離體肝灌流

藥物代謝（drugmetabolism）一般是指藥物的生物轉(zhuǎn)化（drugbiotransformation）。藥物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后，可引起藥物的藥理活性或∕和毒理活性的改變。因此，研究藥物的生物轉(zhuǎn)化，明確其代謝過程，對新藥開發(fā)、新劑型設(shè)計及制定合理的臨床用藥方案等方面都具有重要的指導意義。肝臟是藥物生物轉(zhuǎn)化的重要器官，含有參與藥物代謝重要的酶系（細胞色素P450酶，cytochromeP450，CYP450)，該酶系參與藥物及各種內(nèi)源性和外源性化合物在體內(nèi)的代謝過程。CYP450酶系由三十多種同工酶（亞型）組成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。本文所介紹的各種體外代謝系統(tǒng)均含有一種或多種CYP450酶的同工酶，為研究藥物體外代謝提供了研究的對象和基礎(chǔ)。動物肝體外代謝研究可以較好地排除體內(nèi)因素干擾，直接觀察酶對底物代謝的選擇性，為整體試驗提供可靠的科學依據(jù)。以肝臟為基礎(chǔ)的體外代謝系統(tǒng)主要包括肝微粒體、基因重組CYP450酶系、肝細胞、肝組織切片及離體肝灌流。

1肝微粒體

1.1肝微粒體的制備

多數(shù)采用差速離心法［2］，通過高速離心使微粒體與其他成分分離，操作簡單，無需其他試劑輔助。但較耗時，設(shè)備要求高，使該法的普及和深入研究受到一定的限制。針對這些情況，可采用試劑輔助分離的方法［3］，在離心前額外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促進微粒體沉降。此法對設(shè)備要求降低，并縮短了實驗周期。肝微粒體的制備過程均應在4℃下進行。正確、合理地選擇緩沖液，能起到良好介質(zhì)的作用，按比例加入后進行肝組織的破碎和勻漿，才可有效分離肝微粒體和避免細胞器受損。

1.2肝微粒體的主要應用

1.2.1測定CYP450酶活性

測定原理是在特定酶催化下，底物在輔助因子以及適合的溫度、時間作用下反應，借助儀器測定生成的特定產(chǎn)物量。由于反應可控和周期短，目前大多數(shù)P450酶以肝微粒體作為反應體系進行酶活性的測定［2］。各種酶活性測定的步驟基本相同，差別主要在于酶對應的底物和檢測儀器的選擇。一般以底物及代謝途經(jīng)來命名各種酶，如7乙氧基試鹵靈O脫乙基酶（CYP1A1）［4］、氯唑沙宗羥化酶（CYP2E1）［5］等。根據(jù)底物特性選擇檢測儀器，常用的有紫外∕熒光分光光度計，或聯(lián)用HPLC系統(tǒng)。

1.2.2考察藥物對肝藥酶活性的影響

某些藥物在體內(nèi)不同程度地誘導或抑制肝藥酶活性，這將影響到同時服用的其他藥物的代謝，如抑制CYP3A活性的藥物（如紅霉素等），若與其他經(jīng)這一家族酶代謝的藥物（如西尼地平等）同時服用，則可能減慢其代謝，從而增強藥效或毒副作用［6］。近年來，關(guān)于考察中藥成分對肝藥酶活性影響的報道增多，從體外分子水平來評價它們對肝代謝的影響，可為中藥配伍提供依據(jù)。如代方國等［7］考察給以甘草、甘遂、甘遂甘草配伍藥液的大鼠的肝微粒體中CYP2E1的活性，發(fā)現(xiàn)甘草組和配伍組對CYP2E1活性的誘導作用顯著高于甘遂組；甘遂可能通過誘導肝臟CYP2E1的表達與活性上升；甘遂甘草配伍使用時，甘草對CYP2E1活性的誘導能力更強，故兩者配伍時，可促進甘遂所含前致癌物質(zhì)和前毒物轉(zhuǎn)化成為致癌物和毒物的過程，并導致對機體毒性作用的增強。

1.2.3進行藥物體外代謝途徑研究

將藥物加入肝微粒體中進行孵育后，利用質(zhì)譜檢測離子碎片來鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)，包括藥物不同位點上的羥化物或去烷基產(chǎn)物，從而確定代謝途徑。有報道指出［8］，新型抗焦慮藥AF5加入人肝微粒體中進行孵育，經(jīng)GCMS分析，鑒定出兩種主要代謝產(chǎn)物：4羥基AF5（Ⅰ）及4羰基AF5（Ⅱ）。AF5在肝微粒體中代謝的主要產(chǎn)物為Ⅰ，Ⅰ在人肝微粒體中，可進一步轉(zhuǎn)化為Ⅱ，后者不再被代謝。

1.2.4考察手性藥物的代謝立體選擇性

周權(quán)等［9］把手性藥物與大鼠肝微粒體相結(jié)合，對其立體選擇性代謝作了詳細的考察。作者把R/S普羅帕酮（propafenone，PPF）加入經(jīng)地塞米松或β萘黃酮誘導的大鼠肝微粒體中孵育，經(jīng)提取及手性拆分后，進入HPLC系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，與對照組相比，在經(jīng)誘導的肝微粒體中，PPF的Ⅰ相代謝呈顯著的立體選擇性。

總之，改進后的體外肝微粒體法耗時少，重現(xiàn)性好，易大量操作。適用于酶活性及體外代謝清除等方面的研究，在實際工作中應用較廣。但同其他體外肝代謝方法相比，需要的原材料較多，且與體內(nèi)情況的一致性方面存在不足，因而其結(jié)果是否有利預測體內(nèi)情況仍需進一步研究。

2基因重組人肝微粒體CYP450酶系

利用基因工程及細胞工程，將調(diào)控CYP450酶系表達的基因整合到大腸桿菌或昆蟲細胞，再經(jīng)培養(yǎng)可表達高水平的CYP450酶系，純化后還可獲得較單一的CYP450同工酶。在明確某些藥物經(jīng)特定酶代謝后，即以此酶進行單一代謝，更準確地觀察代謝結(jié)果，避免受其他酶共同參與此代謝途徑的干擾。Ching等［10］通過在酵母中克隆方法，得到高表達的人CYP1A1和CYP1A2，用于測定普萘洛爾對映體的去烴基化和環(huán)羥化反應的立體選擇性和酶動力學參數(shù)，明確了CYP1A2均參與了2種途徑，但CYP1A1只參與了去烴化反應。有學者進一步運用重組人肝微粒體，應用酶抑制劑對普萘洛爾對映體的代謝途徑進行對照實驗［11-13］。其中Yoshimoto等［12］應用基因重組的及人肝微粒體中的CYP酶系同工酶進行研究，發(fā)現(xiàn)α萘黃酮對普萘洛爾R/S對映體的N脫異丙基化（desisopropylation）抑制作用分別為20%和40%；奎尼丁對其2種對映體的4環(huán)羥化代謝的抑制作用較完全；而其他酶抑制劑對其對映體的影響較小。

基因重組CYP450酶系與前述的肝微粒體在研究藥物代謝方面具有一定的相關(guān)性。但前者在藥酶誘導特異性和選擇性研究上優(yōu)于其他的體外方法，并可在分子水平上，為藥物與酶在結(jié)合位點的相互作用研究提供更多的信息。盡管該方法先進性較為突出，但由于受到設(shè)備條件和技術(shù)的限制，通過基因工程獲得的酶量與種類仍較有限，純化程度有待進一步提高，故其作為研究代謝的體外系統(tǒng)的地位仍有待進一步提高。

3肝細胞培養(yǎng)

3.1體外培養(yǎng)技術(shù)與細胞活性的維持

體外培養(yǎng)包括肝細胞株的培養(yǎng)和原代肝細胞的分離與培養(yǎng)。根據(jù)細胞來源于不同，經(jīng)重復篩選可制備出不同型號的肝細胞株，滿足各種實驗需要。肝細胞株容易貼壁存活，在相對穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下，傳20～30代不會出現(xiàn)明顯衰老現(xiàn)象。原代細胞需經(jīng)過從器官中分離的過程，存在分離難度大、體外培養(yǎng)要求條件高、存活時間短、增殖及傳代困難等問題。多數(shù)研究者采用改良的Seglen兩步膠原酶灌注法。但此法操作繁瑣，設(shè)備及實驗技術(shù)要求高，影響因素較多［14］，包括灌注液的種類和速度、肝臟灌洗是否充分、分離消化的酶、培養(yǎng)液的組成和肝細胞懸液的離心清洗等。鑒于上述原因，劉友平［15］等采用肝組織塊貼壁法原代培養(yǎng)，即只把組織塊剪碎，不用膠原酶消化，直接按肝細胞的培養(yǎng)方法進行貼壁培養(yǎng)，在傳代時加胰酶消化，只取上層細胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)。該法簡單快捷，無需灌注、離心，所得肝細胞活力高。

為了解決肝細胞活性體外維持時間短的問題，Hengstler［16］等研究優(yōu)化肝細胞冷凍技術(shù)。同新鮮肝細胞相比，經(jīng)過該技術(shù)冷凍儲藏的肝細胞活性為新鮮肝細胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶的活性>60%，可用于反應時間不超過8h的代謝研究，亦可用于藥酶的誘導研究，但該技術(shù)仍需進一步優(yōu)化。

3.2肝細胞培養(yǎng)的主要應用

3.2.1進行藥物體外代謝途徑與體內(nèi)相關(guān)性研究

Nakagawa等［17］將BPA［2,2bis(4hydroxyphenyl)propane，2,2雙(4羥苯基)丙烷］加于大鼠肝細胞中，經(jīng)質(zhì)譜檢測，BPA很快代謝為單葡萄糖醛酸結(jié)合物及2個次要代謝物（單硫酸結(jié)合物和3OHBPA）。在BPA體內(nèi)代謝研究中發(fā)現(xiàn)，約20%～30%的BPA從尿中排泄，主要為首過效應中生成的葡萄糖醛酸結(jié)合物，其中硫酸結(jié)合物占尿液中總代謝物的2%～3%［18］。因此BPA肝細胞體外溫孵與體內(nèi)過程很相似，具有一定的代表性。

3.2.2進行藥物體外代謝清除研究

Shibata［19］等人運用冷藏保存的人肝細胞混懸于100%的人血漿中，將預測的肝利用度及清除率與14種臨床常用的藥物的生物利用度和血漿清除率進行比較時，發(fā)現(xiàn)不同的細胞來源，內(nèi)在清除率存在極大的個體差異性。同時在基礎(chǔ)的生物定標系數(shù)（3.1×109個/kg）下，用外推法將體外實驗結(jié)果應用于體內(nèi)實驗的預測，往往會出現(xiàn)明顯的偏低現(xiàn)象，因此計算的定標系數(shù)應比基礎(chǔ)生物大3～5倍。為獲得更可靠的定量預測結(jié)果，通過預試驗來確定校正的定標系數(shù)是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

由于在新鮮分離的肝細胞中，介導藥物代謝的CYP450酶系存在時間依賴性衰減的現(xiàn)象，所以一般的肝細胞培養(yǎng)都要求在肝細胞生存時間跨度內(nèi)進行。Griffin和Houston［20］對體外單層肝細胞培養(yǎng)的內(nèi)在清除能力（CLint）與新鮮游離肝細胞懸液的清除能力進行比較，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在的清除能力與代謝速度有關(guān)，單層肝細胞體外實驗更適合于代謝速度慢的藥物。

總之，用肝細胞培養(yǎng)方法作為評價藥物代謝的體外系統(tǒng)，存在一定的偏差。其結(jié)果與體內(nèi)的情況相近程度，很大程度上取決于研究者的經(jīng)驗。

3.2.3參與新型多器官共培養(yǎng)的研究

在很長一段時間內(nèi)，研究者都只是單純考察藥物代謝在某一種器官（如肝臟）中的作用情況。而實際上，藥物在體內(nèi)的過程是多因素綜合作用的。根據(jù)最新報道［21］，肝細胞參與整體非連續(xù)性多器官共培養(yǎng)體系（IdMOC），即把肝細胞和來自于其他多個器官的非肝原代細胞一起培養(yǎng)，為在藥物代謝和毒副效應方面評價多器官之間的相互作用提供可能性。

肝細胞同肝微粒體相比，在代謝物生成、體外代謝清除等研究方面有許多相似性，但針對代謝物種類、主要代謝物及所反映的代謝特性上存在著質(zhì)或量的差異。隨著肝細胞冷凍技術(shù)的發(fā)展，因其體外活性維持時間短而造成的應用限制會不斷得到改善。

4肝組織切片

在各種器官組織切片中以肝切片的應用最多，可在較長的孵育時間內(nèi)保持代謝活性。據(jù)報道，小鼠肝切片可培育3～5d［22］。組織切片的實驗與培育條件使得其重現(xiàn)性比灌注器官的重現(xiàn)性容易得多。切片制備相對快捷而簡便。但其缺點為切片機的大量使用受限，而且價格昂貴。DeKanter［23］等利用利多卡因、睪酮及7乙氧基香豆素為探針藥物，進行了器官切片實驗，結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有多相代謝途徑，且易于比較不同器官組織的代謝差別。研究發(fā)現(xiàn)不同種屬及不同器官間代謝類型及速度不同。

Vickers［24］用肝組織切片研究環(huán)孢素A（CSA）的代謝，CSA本身是CYP3A4的底物，但在人肝切片中加入1～10mol/LCSA培育24h，使CYP3A4活性降低了25%，說明在CSA高濃度時可減少本身的清除率而提高血藥濃度。若用某些疾病的標記物加入肝組織切片中培育，也可研究藥物的不良反應如對肝的損害（以GSP或核基質(zhì)蛋白Numa為標記物）或?qū)χ|(zhì)代謝的影響（以Lp(a)為標記物）等。

組織切片完整地保留了所有的肝藥酶及細胞器的活性，而且保留了一定的細胞間質(zhì)。這些特點相比于分子水平和細胞水平，更具宏觀性與整體性，更能反映藥物在體內(nèi)生理情況下的實際代謝過程，為分子理論與離體器官之間，乃至臨床應用架起了橋梁。

5離體肝灌流

5.1肝臟灌注的特點

肝臟灌流技術(shù)作為一種與在體肝臟最具可比性的體外系統(tǒng)，有其突出的優(yōu)點是可以在接近生理狀況的條件下進行肝功能研究，保持完整細胞的天然屏障和營養(yǎng)液的供給，能排除其他組織、臟器的干擾及便于動態(tài)定量分析受試物及其代謝產(chǎn)物。因而離體器官灌注處于體內(nèi)與體外的臨界點。然而肝臟灌流技術(shù)亦存在缺陷，如受時間的限制、易受其他因素的干擾（如手術(shù)操作、灌流液組成、流速等）,手術(shù)及插管操作技術(shù)極復雜。

5.2離體肝灌流的主要應用

5.2.1持續(xù)考察藥物代謝

利用離體肝的生理活性進行持續(xù)性的藥物代謝考察及某些生命物質(zhì)與藥物之間的相互作用，以此有效預測體內(nèi)－體外的相關(guān)性。Wang等［25］運用大鼠肝灌流，測定美托洛爾的Vmax和KM、代謝物的增加量和氨基酸的減少量，以此考察氨基酸對美托洛爾的抑制作用。結(jié)果顯示：氨基酸可逆地減少了母藥及代謝物的Vmax約50%，而對KM則影響不明顯。氨基酸可能直接抑制了代謝美托洛爾的酶。因此估計多種類似代謝機制可有效影響人體內(nèi)食物與高首過效應的藥物。應用離體肝臟灌注，定性和定量檢測灌流液中的母體藥物及代謝產(chǎn)物濃度，可了解受試化學物質(zhì)在肝臟內(nèi)所發(fā)生的代謝變化及反應類型。

5.2.2藥物首過效應的研究

首過效應明顯的藥物，生物利用度低，這在臨床合理用藥中受到重視。在藥物研究過程中，應用分離肝細胞、肝勻漿、肝微粒體等體外方法雖可揭示藥物肝臟代謝的機制和相關(guān)代謝酶系，但不能提供關(guān)于體內(nèi)首過代謝程度的信息。Lau等［26］利用離體灌注大鼠肝模型，研究利福平對阿托伐他汀及其代謝物的生物轉(zhuǎn)化的影響，認為口服阿托伐他汀生物利用度極低與首過效應有關(guān)，尤其是存在明顯的腸道首過效應。

5.2.3藥物相互作用的研究

Lucas［27］等應用一過式離體大鼠肝臟灌流模型研究了植物雌激素異黃酮對硫酸干擾乙酰氨基酚在肝臟形成及處置的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)l0μmol的異黃酮混合物能減少硫酸對乙酰氨基酚的形成，減少對乙酰氨基酚的肝清除。

6結(jié)語

肝體外代謝系統(tǒng)廣泛應用于藥物代謝研究的各個方面，在不同研究背景下互相補足。肝微粒體代謝快，易大量操作，近年來在大量文獻中用于酶活性及體外代謝清除等方面的研究，在實際工作中應用較廣。基因重組CYP450酶系在分子水平上的“單一性”為深入研究藥酶誘導的“特異性”和“選擇性”提供了技術(shù)支持。肝細胞所保持的完整微觀結(jié)構(gòu)，針對代謝特性及多種細胞共同作用等方面，均有較好的研究空間。而組織切片所保留的細胞器和細胞間質(zhì)，以及離體肝灌注所保持的正常生理活性，可更全面地在“體外”這個層面上，為前3種微結(jié)構(gòu)系統(tǒng)與體內(nèi)一致性方面所存在的不足進行補充和完善。因此，根據(jù)各系統(tǒng)的特性，不同的要求和目的，分別選擇應用，才能正確解釋實驗的結(jié)果，才能更好地接近臨床實踐。

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