前言：本站為你精心整理了青霉素結(jié)合蛋白測(cè)定技術(shù)范文，希望能為你的創(chuàng)作提供參考價(jià)值，我們的客服老師可以幫助你提供個(gè)性化的參考范文，歡迎咨詢。

【論文摘要】當(dāng)前,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來(lái)困難,對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)改變?cè)斐傻哪退幮?是β-內(nèi)酰胺類抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs

當(dāng)前，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來(lái)困難，對(duì)卜內(nèi)酞胺類抗生素而言，某些菌青霉素結(jié)合蛋白(PBps)改變?cè)斐傻哪退幮?，是卜?nèi)酞胺類抗生素的特點(diǎn)。一般細(xì)菌的PBPs均為胞漿膜上的蛋白質(zhì)，是細(xì)菌致死的靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與卜內(nèi)酞胺類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的方法研究PBPs圖譜，以便了解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以，PBPs測(cè)定技術(shù)是研究壓內(nèi)酸胺類耐藥性的重要手段[l]。的穿透力弱，用一般放射自顯影法不能獲得PBPs圖譜，需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法”。國(guó)內(nèi)有關(guān)PBps測(cè)定技術(shù)報(bào)道甚少，以3H標(biāo)記者更少，本文介紹這一技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種肺炎鏈球菌31003，30301(北京藥品生物制品檢定所;Pen08.R6本室保存菌種。

1.1.2培養(yǎng)基C+Y培養(yǎng)基，參見文獻(xiàn)(2)。

1.1.3僅器及藥品

垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠);NG一l型真空凝膠干燥器(太倉(cāng)電視機(jī)廠);TGLL一1a型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(中科院上海生物化學(xué)研究所);8438一超低溫冰箱(FormaSclentifi。，美國(guó));電泳儀DY一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(Aerylamide，臨海止學(xué)廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(big;瑞士產(chǎn)品);N，N，N，N一四甲基乙二胺(TEMED，上海前進(jìn)農(nóng)場(chǎng)制劑廠);3H標(biāo)記青霉素乙酞呱陡鹽(NewEngiandNuclear，美國(guó));x光底片(天津感光材料廠;KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em);2，5一二苯基嗯哇(PPO，閃爍純，上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(Sarkosyl，Sigma);十二烷基硫酸鈉(SDs，上海新華化工廠);二甲基亞礬(DMso，北京旭東化工廠)。

1.2方法

1.2.1肺炎鏈球菌PBPs樣品的制備將肺炎鏈球菌按種c+Y培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日再移種新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2~3h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌數(shù)約為個(gè)/ml(CFU/ml)，菌液分裝試管，每管lml于冰浴中加入不同濃度的氖標(biāo)記青霉素37℃保溫10min，在冰浴中加入5非標(biāo)記青霉素G鈉鹽20萬(wàn)單位/ml，冷凍離心5000:/minlom仇，棄去上清，菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(PH6.8)做成菌懸液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl，37℃保溫10min使細(xì)胞溶解，加入30協(xié)一樣品緩沖液，煮沸3min，置室溫備用。

1.2.2聚丙烯魷胺凝膠電泳采用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDSPAGE)方法。制備凝膠薄片(厚0.2cm)，凝膠配方:分離膠(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml，Tris(pH8.8，1.5ml/l)5ml，10%SDS0.2ml，蒸餾水8.1ml，真空攪拌10一15min除去氣體，再加入TEMED,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7ml，2.5ml，0.1而，5.6ml，7.5，和150。先配制分離膠，灌注直立式電泳槽后，使凝膠凝固。次日加入濃縮凝膠，放入加樣梳，靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別加入PBps樣品。接通電流，第一小時(shí)維持電壓在60v，至染料前沿到達(dá)分離膠和濃縮膠交界處調(diào)高電壓至120v，走完全程約需3一4h，用考馬斯藍(lán)R250染色30一45min，過(guò)夜脫色。

1.2.3關(guān)光放射自顯影方法凝膠片用二甲基亞礬(DMSo)處理30min，再用新鮮DMSo再次處理30而n，20%即。處理2一3h，l%甘油和1%乙酸處理lh，將凝膠片貼附在厚濾紙上，使用凝膠真空干燥器進(jìn)行真空干燥，將凝膠片和x光底片貼緊，置于x光射線暗匣內(nèi)，放超低溫冰箱一70℃使曝光1~Zwr，將x光底片顯影，定影，沖洗得到PBPs的放射自顯影圖譜。x光底片預(yù)曝光條件:(1)國(guó)產(chǎn)x光底片用照相閃光燈紅色濾光片，加6層紅色玻璃紙濾過(guò)，x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙，距離50cm，閃光燈閃二次;(2)進(jìn)口x光底片預(yù)曝光用x光機(jī)最小功率100mA40kV，距離40em，每張x光底片曝光0.04s。

1.2.4竟?fàn)幮越Y(jié)合試驗(yàn)定量菌液中分別加入不同濃度的甲氧西林保溫37℃10min，然后加入飽和量的氛標(biāo)記青霉素，37℃保溫10min，再按上述方法繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與討論

本法測(cè)定肺炎鏈球菌全細(xì)胞中pBps的含量，首先需要分離菌體蛋白，為使菌體蛋白濃度維持在一定的水平上，必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約CFU/ml。肺炎鏈球菌破碎細(xì)胞的方法以采用離子型去污劑sarkosyl為宜，它能選擇性地作用于胞漿膜(3)，使胞漿膜破裂，菌體蛋白釋放出來(lái)，與此同時(shí)，已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白PBPs也一起釋放出來(lái)。樣品制備完畢，煮沸3min，以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾，青霉素與PBPs結(jié)合較牢固，不會(huì)被破壞。

本實(shí)驗(yàn)采用SDS一PAGE方法(4-5)，SDS在分離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%。

氖標(biāo)記物穿透力較弱，用一般放射自顯影方法不能得出圖象，本實(shí)驗(yàn)采用熒光放射自顯影法(6-8)(Fluoro，aphy)，檢測(cè)聚丙烯酞胺凝膠片上3H標(biāo)記的蛋白質(zhì)，有一定的優(yōu)點(diǎn)。PPO是熒光增效劑，其作用原理不是直接依賴sH放射出來(lái)的日射線，而是藉助3H上的日粒子與PPO相互作用發(fā)射出的光，造成x光底片的局部發(fā)黑得到深淺不同的暗線，從而獲得青霉素結(jié)合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的PBPs圖譜上可見有三條區(qū)帶，即p即;(a，b)，pBpZ和pBp3。一般情況下，青霉素濃度越大，親和力越強(qiáng)，顏色越深，在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，甲氧西林濃度越大，親和力越強(qiáng)，顏色越淺。

據(jù)報(bào)道(7-9)，x光底片預(yù)曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度，.因?yàn)轭A(yù)曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖象吸收值之間的非線性關(guān)系，所以，經(jīng)預(yù)曝光的x光底片上所得到的圖象可以正確反映出樣品的放射性分布情況。

用國(guó)產(chǎn)x光底片不經(jīng)預(yù)曝光時(shí)，無(wú)圖象出現(xiàn)，經(jīng)預(yù)曝光則有圖象出現(xiàn)(見圖1)，用進(jìn)口x光底片未經(jīng)預(yù)曝光者，圖象的暗線區(qū)別不大(見圖2)。預(yù)曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖象(見圖3)。國(guó)產(chǎn)x光底片與進(jìn)口x光底片比較，國(guó)產(chǎn)片敏感性較低，預(yù)曝后的x光底片上出現(xiàn)的暗線普遍較淺且細(xì)，PBPI。不可見。

參考文獻(xiàn)

1錢海倫.細(xì)菌對(duì)卜內(nèi)酞胺類抗生素耐藥性的研究進(jìn)展.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989;20(3):188

2錢海倫，李靜.肺炎球菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基和菌種保存方法的研究.徽生物學(xué)通報(bào)，1989;16(l):15

3FilipC,FletcherG,WulffJ.SolubilizationofthecytoplasmicmembraneofE.cdibytheionicdetergentsodium-laurylsarceginate.JBialChem1973;115(3):717

4AmenGF.Resolutionofbacterialproteinsbypolyacrylamidrgelelectrophoresisonslabs.JBialChem1974;249(2):293

5ZighelboimS.MechanismofResistancetopenicillininStrelrtac1981，7(3):169

6BannerRA,hskeyRA.Afilmdetectionmethodfortritium-labelledproteinsandnucleicacidsinpolyacrylamidegels.9ra}JBiachem1974;48,83

7LaskeyRA,MillsAD.Quantitativefilmdetectionof3Hand"Cinpolyacrylamidegelsbyfluorography.EurJBPOCl1NR1975;58;333

8WilliamsonR,HaokenbeckR,TomaszA.IsrnvoInteractionof(ilactamantibioticswiththepenicillin-bindingproteinsofSLrey(acrocawrynaanwaiae.AalamecrobAgentsC1980;18(14):629

9王蘇生，舒群芳，周芬凝膠中同位素測(cè)定的快速熒光自顯影方法.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1986;6:66