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本文作者：魏寶東1李強(qiáng)1齊欣2作者單位：1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局莊河分中心

β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)，俗稱抗生素分解劑，又名解抗劑或金玉蘭酶制劑，是β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌株分泌的一種胞外酶[1]，該酶可選擇性分解β-內(nèi)酰胺類抗生素。β-內(nèi)酰胺酶破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)有2種作用機(jī)制：第一，依賴絲氨酸發(fā)揮作用的機(jī)制。此類β-內(nèi)酰胺酶包括分子生物學(xué)分類方法中的A、C、D3類酶[2-3]，本研究所用酶屬于A類酶中的TEM型。它們的活性位點(diǎn)具有1個(gè)狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu)，在溝的底部形成了一個(gè)空腔(氧陰離子袋)，構(gòu)造疏松，容易彎曲，便于結(jié)合底物。由于β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時(shí)發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，使其成為開環(huán)物，重建了β-內(nèi)酰胺酶。這類酶對(duì)青霉素、頭孢菌素和單內(nèi)酰環(huán)類抗生素都有降解作用。第二，依賴金屬離子的機(jī)制。這類酶是指金屬類β-內(nèi)酰胺酶(B類β-內(nèi)酰胺酶)，其作用機(jī)制是利用一個(gè)二價(jià)金屬離子(多為鋅離子)，分別與半胱氨酸或組氨酸結(jié)合，或同時(shí)與二者結(jié)合，并與β-內(nèi)酰胺類抗生素的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使其不能發(fā)揮作用[2-3]。此類酶主要對(duì)青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯類抗生素有作用，但對(duì)單內(nèi)酰環(huán)類抗生素?zé)o效。青霉素在β-內(nèi)酰胺酶作用下，酶中親核性基團(tuán)向β-內(nèi)酰胺環(huán)進(jìn)攻，開環(huán)后可脫羧重排生成中間體青霉噻唑酸，同時(shí)伴隨生成青霉稀酸、青霉酸、青霉胺、青霉醛等小分子物質(zhì)[4]。如果在牛奶中使用了解抗劑來降解添加的抗生素，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。為了杜絕假陰性現(xiàn)象的出現(xiàn)，對(duì)青霉噻唑酸的檢驗(yàn)就顯得至關(guān)重要。一方面，青霉噻唑酸具有半抗原的性質(zhì)，可以用作酶聯(lián)免疫研究，制成快速檢測(cè)的試劑盒，以保障原料乳的安全。另一方面，經(jīng)過純化的青霉噻唑酸可以作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，建立高效液相色譜的檢測(cè)方法，從而對(duì)原料乳中的青霉噻唑酸進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，杜絕抗生素過量添加的現(xiàn)象。本研究用β-內(nèi)酰胺酶對(duì)青霉素鈉進(jìn)行降解，探討了不同降解條件對(duì)降解效果的影響，并優(yōu)化得出了具體工藝參數(shù)，可以為青霉噻唑酸的制取提供必要的工藝參考，同時(shí)為青霉噻唑酸的檢測(cè)研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑

注射用青霉素鈉：哈藥集團(tuán)制藥總廠；注射用舒巴坦鈉：華北制藥股份有限公司，用pH7.0的na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制成濃度為2.0mg/mL的溶液；β-內(nèi)酰胺酶(酶活≥1000U/mg)：上海晶純?cè)噭┯邢薰?，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制成濃度為500U/mL的酶液；牛肉浸膏、蛋白胨：生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂：福建泉州市泉港化工廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2指示菌種

大腸桿菌：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院保存。

1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.2~7.4。

1.4儀器與設(shè)備

SYQ-DSX-280A型手提式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9006型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：南京電器三廠；牛津杯(外徑8mm)；培養(yǎng)皿(90mm)。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1抑菌效果試驗(yàn)

采用杯碟法[5-7]。取大腸桿菌原菌種，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)20h。用10mL無菌水洗下菌苔，制成濃度約為109cfu/mL的菌懸液。用無菌槍頭吸取100μL菌懸液，加注到無菌的瓊脂平板中，立即用無菌涂布棒均勻涂布，制成含菌平板。在平板中央放置1個(gè)牛津杯，用無菌槍頭吸取200μL降解液小心地注入到牛津杯中，置于37℃的條件下培養(yǎng)20h，觀察抑菌效果。

1.5.2溫度對(duì)青霉素鈉降解的影響

取6支試管分別加入注射用青霉素鈉10mg，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液配制成濃度為2.0mg/mL的溶液。每支試管中加入β-內(nèi)酰胺酶60U，分別在35、36、37、38、39、40℃的條件下降解60min，降解完成后立即加入0.5mL舒巴坦鈉以終止酶解反應(yīng)。

1.5.3降解時(shí)間對(duì)青霉素鈉降解的影響

將6支試管分別置于37℃的恒溫水浴鍋中降解40、50、60、70、80、90min，其他操作不變。

1.5.4酶用量對(duì)青霉素鈉降解的影響

試管中分別加入β-內(nèi)酰胺酶55、60、65、70、75、80U，置于37℃的恒溫水浴鍋中降解60min，其他操作不變。

1.5.5降解體系pH對(duì)青霉素鈉降解的影響

分別考察降解體系pH值為5.8、6.1、6.4、6.7、7.0、7.3時(shí)的降解情況，其他操作不變。

1.5.6酶降解條件的優(yōu)化

在酶解條件單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)降解溫度、降解時(shí)間、酶用量和降解體系pH值4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以降解液的抑菌情況為指標(biāo)，對(duì)酶解條件進(jìn)一步優(yōu)化，探索出β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素鈉的最佳條件組合。因素水平如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1溫度對(duì)青霉素鈉降解的影響

不同溫度下降解液的抑菌效果如表2所示。由表2可以看出，當(dāng)降解溫度＜37℃時(shí)，有抑菌圈產(chǎn)生。這是因?yàn)榇藭r(shí)溫度偏低，分子活動(dòng)溫和，β-內(nèi)酰胺酶分子和青霉素鈉分子之間碰撞的機(jī)會(huì)偏少，造成β-內(nèi)酰胺酶未與青霉素鈉有效地結(jié)合，青霉素鈉未被完全降解。隨著溫度的升高，酶的反應(yīng)速度成倍增長，當(dāng)溫度在37~39℃時(shí)，分子活動(dòng)劇烈，酶和底物分子之間的碰撞機(jī)會(huì)增加，青霉素鈉被完全降解，失去抗菌活性，故無抑菌圈出現(xiàn)。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，過高的溫度導(dǎo)致部分酶蛋白發(fā)生不可逆失活，其催化作用受到影響，使得青霉素鈉的降解反應(yīng)未進(jìn)行完全，降解液仍存在抗菌活性。因此，在37~39℃范圍內(nèi)均可作為β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素鈉的最佳溫度選擇。

2.2降解時(shí)間對(duì)青霉素鈉降解的影響

不同的降解時(shí)間會(huì)對(duì)青霉素鈉的抗菌活性造成不同的影響，表3為青霉素鈉經(jīng)過不同的降解時(shí)間后，降解液的抑菌情況。酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)表明，酶解是一個(gè)有一定時(shí)間差的過程，當(dāng)酶解產(chǎn)物累積到一定濃度后會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生反饋抑制，反應(yīng)速度也會(huì)隨之變慢，所以酶解并非時(shí)間越長越好。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)降解時(shí)間為40min和50min時(shí)，酶解反應(yīng)并未進(jìn)行完全，降解液中仍有部分青霉素鈉，故有抑菌圈出現(xiàn)。當(dāng)降解時(shí)間達(dá)到60min時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶有足夠的時(shí)間同青霉素鈉結(jié)合，進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)，β-內(nèi)酰胺環(huán)全部被破壞，失去抗菌活性。同理，降解時(shí)間＞60min時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶則更能充分發(fā)揮催化作用，降解反應(yīng)進(jìn)行完全，所以經(jīng)過60～90min的降解后，都沒有抑菌圈出現(xiàn)?？紤]到時(shí)間因素和試驗(yàn)的便利程度，選擇60min作為最佳降解時(shí)間。

2.3酶用量對(duì)青霉素鈉降解的影響

不同的酶用量對(duì)青霉素鈉的降解效果不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。當(dāng)酶用量為55U時(shí)，酶量相對(duì)不足，酶分子全部與青霉素鈉分子結(jié)合，但仍有部分青霉素鈉分子未與β-內(nèi)酰胺酶相結(jié)合，這部分青霉素鈉未被降解，仍然保持抗菌活性。當(dāng)酶用量為60U時(shí)，酶分子的數(shù)量已經(jīng)足夠與所有的青霉素鈉分子有效結(jié)合，催化反應(yīng)速度加快，青霉素鈉完全被降解，抗菌活性消失，故酶用量在60~80U時(shí)，抑菌試驗(yàn)都沒有抑菌圈出現(xiàn)?？紤]到成本因素，選取最佳酶用量為60U即可。

2.4降解體系pH值對(duì)青霉素鈉降解的影響

不同降解體系pH值會(huì)對(duì)降解反應(yīng)的進(jìn)行程度造成不同的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。pH值對(duì)降解反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在對(duì)β-內(nèi)酰胺酶空間構(gòu)象的影響上，因?yàn)槊傅谋举|(zhì)是蛋白質(zhì)，pH值的改變會(huì)改變酶分子的空間構(gòu)象，極限pH會(huì)導(dǎo)致酶喪失活性，使酶的催化作用受到影響。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)降解體系的pH值為5.8~6.4時(shí)，緩沖液呈弱酸性，β-內(nèi)酰胺酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起酶構(gòu)象的改變，因此其活性受到部分抑制，又因?yàn)榍嗝顾卦诮到膺^程中主要生成青霉噻唑酸，青霉噻唑酸是一種強(qiáng)酸，也會(huì)對(duì)磷酸鹽緩沖體系造成一定的沖擊，所以在此條件下β-內(nèi)酰胺酶部分變性失活，致使青霉素鈉未被完全降解，依然存在一定的抑菌活性。而當(dāng)降解體系的pH值在6.7~7.0時(shí)，達(dá)到了β-內(nèi)酰胺酶作用的最適pH范圍，其催化效率提高，可以使青霉素完全被降解，抗菌活性喪失。當(dāng)降解體系的pH值為7.3時(shí)，溶液呈弱堿性，一方面可能會(huì)影響到β-內(nèi)酰胺酶活性部位催化基團(tuán)和結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，另一方面青霉素鈉本身在堿性條件下容易發(fā)生水解反應(yīng)，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的降解作用造成一定程度的掩蓋，所以不宜選擇7.3作為降解體系的最適pH值。故選擇7.0作為β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素鈉的最適降解pH值。

2.5酶解條件的優(yōu)化

運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)酶降解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表6所示。由正交試驗(yàn)的結(jié)果可看出，處理4、6、8均沒有抑菌圈出現(xiàn)，說明3個(gè)處理均可以使青霉素鈉完全降解。但在處理4和處理8中，降解體系的pH值都是7.3，青霉素鈉在此條件下容易引發(fā)自身水解反應(yīng)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成一定的偏差，所以不宜選擇處理4和處理8作為最佳酶解條件組合。在處理6中，酶解時(shí)間需要75min，僅比處理4多10min，處在可接受的范圍內(nèi)，而且加酶量為60U，比起處理8更能節(jié)約成本。綜合以上分析，選擇處理6為酶解條件的最優(yōu)組合，即β-內(nèi)酰胺酶降解注射用青霉素鈉的最優(yōu)條件組合為：降解溫度37℃、降解時(shí)間75min、酶用量60U、降解體系pH值7.0。

3結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，降解溫度、降解時(shí)間、酶用量和降解體系pH值均能對(duì)β-內(nèi)酰胺酶降解青霉素鈉造成一定程度的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)確定了降解的最佳條件組合為：降解溫度37℃、降解時(shí)間75min、酶用量60U、降解體系pH值7.0，在此條件下，青霉素鈉可以被完全降解，失去抗菌活性。β-內(nèi)酰胺酶是一個(gè)復(fù)雜的酶系，降解完成后對(duì)它的滅活是一個(gè)棘手的問題。由于青霉素鈉分子中存在β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，決定了它的高度不穩(wěn)定性[8-9]，所以不能用高溫加熱的方法滅活降解液中的β-內(nèi)酰胺酶。有機(jī)溶劑、重金屬離子則有可能對(duì)指示菌的生長造成一定的影響，使試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，故常規(guī)的滅活方法均不可用于本研究中β-內(nèi)酰胺酶的滅活。本研究中選擇β-內(nèi)酰胺酶的特異性抑制劑舒巴坦來抑制其活性，以終止降解反應(yīng)。舒巴坦是一個(gè)廣譜酶抑制劑，在較低濃度時(shí)，即可對(duì)II、III、IV和V型β-內(nèi)酰胺酶具有很強(qiáng)的不可逆抑制作用[10]，其作用原理為首先通過與β-內(nèi)酰胺酶作用形成?；a(chǎn)物I，然后I的噻唑環(huán)開環(huán)生成中間體II，II重排后得到不易水解的β-氨丙稀酸類化合物III，?；a(chǎn)物I及其開環(huán)生成的中間體II可水解得到活化酶和水解產(chǎn)物，II和III還可進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡媸Щ町a(chǎn)物，而使酶失活[11]。而且，經(jīng)過試驗(yàn)，舒巴坦并未對(duì)指示菌的生長造成明顯的影響，作為降解反應(yīng)的終止劑可以放心使用。但是，高濃度的舒巴坦對(duì)于指示菌的影響程度如何，仍需要進(jìn)一步的研究。β-內(nèi)酰胺酶雖然在一定條件下可以對(duì)青霉素等抗生素進(jìn)行完全降解，但這并不意味著在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過添加β-內(nèi)酰胺酶的方式來生產(chǎn)“無抗奶”。因?yàn)?，一方面?內(nèi)酰胺酶的食用安全性尚未得到準(zhǔn)確的論證，另一方面抗生素的降解產(chǎn)物可能對(duì)人類健康造成潛在的威脅，引起諸如過敏之類的癥狀。衛(wèi)生部已經(jīng)明確指出“添加β-內(nèi)酰胺酶(解抗劑)等非食品用物質(zhì)屬違法行為”。盡管如此，仍有一些不法生產(chǎn)者為了牟取超額的經(jīng)濟(jì)利潤，人為地添加解抗劑去降解牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)人造“無抗奶”。目前，目前國家還未出臺(tái)β-內(nèi)酰胺酶的國標(biāo)檢測(cè)方法，面對(duì)越來越嚴(yán)重的解抗劑濫用現(xiàn)象，建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法迫在眉睫。