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本文作者：趙婷、姚粟、李輝、薛強(qiáng)偉、程池單位：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心、山東優(yōu)福蟲草素生物科技有限公司

蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)為天然冬蟲夏草(Cordycepssinensis)中分離到的內(nèi)寄生菌,其菌絲體發(fā)酵物具有廣泛的藥理活性,如降血脂、止咳祛痰、鎮(zhèn)靜、解痙等[1]。蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)已列入衛(wèi)生部(2001)84號文件《可用于保健食品的真菌菌種名單》。目前,已實(shí)現(xiàn)蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)發(fā)酵法生產(chǎn)菌絲體作為冬蟲夏草藥材的替代藥品或保健品[2]。2010年新版GMP實(shí)施后,為加強(qiáng)保健食品生產(chǎn)管理,國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)于2011年9月了《保健食品良好生產(chǎn)規(guī)范(修訂稿)》征求意見稿,生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行保健食品產(chǎn)品申報時,應(yīng)遵循:“菌絲體原料、益生菌類原料和藻類原料采購應(yīng)當(dāng)索取菌株或品種鑒定報告、穩(wěn)定性報告和不含耐藥因子的證明材料。”其中,藥敏試驗(yàn)的要求是從微生物菌種或其代謝產(chǎn)物的食用安全方面考慮,以避免外源耐藥因子帶入體內(nèi)而引起耐藥性。然而,對于產(chǎn)孢絲狀真菌的藥敏檢測,尤其是應(yīng)用于保健食品產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)孢絲狀真菌,目前國內(nèi)缺乏相關(guān)的檢測方法、標(biāo)準(zhǔn)及檢測機(jī)構(gòu),本文參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)M38-A2《肉湯稀釋法抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方案》[3]對蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)進(jìn)行了藥敏檢測,期望為相關(guān)檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)的建立提供部分技術(shù)依據(jù),進(jìn)而更好地服務(wù)于廣大保健食品生產(chǎn)企業(yè)。

1材料

1.1試驗(yàn)菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali),由山東優(yōu)福蟲草素生物科技有限公司提供。

1.2質(zhì)控菌株滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)AS2.1846T=ATCC22019T,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3抗真菌藥物試驗(yàn)所用6種抗真菌藥物,均購自中國食品藥品檢定研究院,配制成儲存液置20°C備用,相關(guān)信息見表1。

1.4培養(yǎng)基及試劑RPMI-1640液體培養(yǎng)基(含谷氨酰胺,不含碳酸氫鹽,含酚紅作為pH值指示劑),購自美國ThermoFisher公司;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;三氮嗎啉丙磺酸(MOPS),購自美國Amresco公司;96孔滅菌酶標(biāo)板購自美國Costar公司。

2方法

2.1微量藥敏板制備抗真菌藥物按照使用說明操作,直接或80°C干燥至恒重后,稱量0.0160g伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺,分別溶于10.0mLDSMO中,配制成1600mg/L的存儲液,稱量0.0512g5-氟胞嘧啶、氟康唑,分別溶于10.0mL無菌蒸餾水中,配制成5120mg/L的存儲液,置20°C儲存?zhèn)溆?。用DMSO將非水溶性藥物儲存液按1:50稀釋至2倍終濃度,即伊曲康唑、酮康唑、伏立康唑、環(huán)吡酮胺為32mg/L,用RPMI-1640液體培養(yǎng)基(以終濃度為0.165mol/L的MOPS為緩沖液,25°C調(diào)節(jié)pH7.0)將水溶性藥物儲存液按1:40稀釋至2倍終濃度,即5-氟胞嘧啶、氟康唑?yàn)?28mg/L。取無菌96孔酶標(biāo)板,在第1孔加入稀釋后的抗真菌藥物200μL,第212孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基100μL。從第1孔吸取100μL藥液加入第2孔,充分混勻后吸取100μL加入第3孔,依次做倍比稀釋至第12孔,第12孔的藥液混勻后吸取100μL棄去。配置好的藥敏板從第1孔至第12孔藥物濃度由高到底為320.0156mg/L或1280.0625mg/L。另設(shè)空白對照及未加藥物的生長對照,非水溶性藥物對照中加入1μLDSMO。

2.2供試菌株孢子懸液制備將供試菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上25°C培養(yǎng)710d,用1mL無菌0.85%生理鹽水沖洗孢子,轉(zhuǎn)入無菌試管,靜置5min,取上部均質(zhì)孢子懸液于另一無菌試管,渦旋振蕩15s,用分光光度計(jì)校正孢子懸液濃度至(0.45.0)×104CFU/mL(波長530nm時,OD值為0.090.13)。

2.3孢子懸液濃度質(zhì)控驗(yàn)證將蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)孢子懸液梯度稀釋后,取0.01mL涂布于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上,25°C28°C培養(yǎng)15d,菌落計(jì)數(shù)以驗(yàn)證孢子懸液濃度。

2.4接種在96孔板的112列孔每孔加入100μL的孢子懸液,25°C靜置培養(yǎng),48h后觀察結(jié)果。

2.5MIC(最低抑菌濃度)值判讀伊曲康唑、伏立康唑MIC值為肉眼觀察100%抑制生長的藥物濃度;環(huán)吡酮胺MIC值為肉眼觀察80%及以上抑制生長的藥物濃度;氟康唑、酮康唑MIC值為肉眼觀察50%及以上抑制生長的藥物濃度;5-氟胞嘧啶沒有規(guī)定,暫定MIC值為肉眼觀察50%及以上抑制生長的藥物濃度[45]。試驗(yàn)菌株均做2次重復(fù),試驗(yàn)結(jié)果由至少2人共同判讀,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3結(jié)果

3.1方法質(zhì)控6種抗真菌藥物對質(zhì)控菌株滑假絲酵母(C.parapsilosis)ATCC22019T的MIC值檢測結(jié)果見表2,質(zhì)控菌株MIC檢測值均在參考范圍之內(nèi),表明實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果可信。

3.2接種量經(jīng)分光光度計(jì)測定,試驗(yàn)菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)孢子懸液在波長530nm時OD值為0.09,經(jīng)平皿菌落計(jì)數(shù)驗(yàn)證,孢子懸液濃度為1.1×104CFU/mL,兩者結(jié)果相互吻合。3.3MIC值判讀6種抗真菌藥物對蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)的MIC值檢測結(jié)果見圖1,試驗(yàn)菌株除5-氟胞嘧啶外,其他藥物MIC值拐點(diǎn)均落于設(shè)定的藥物濃度范圍之內(nèi),5-氟胞嘧啶根據(jù)判讀標(biāo)準(zhǔn)MIC值為≥128mg/L。圖2給出了蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在微量藥敏板上25°C培養(yǎng)48h后的生長照片,直觀地顯示了供試菌株的生長情況,由于菌株生長代謝產(chǎn)酸,可以明顯看出含酚紅作為pH值指示劑的生長孔顏色變黃。CLSIM100-S21《抗微生物藥敏試驗(yàn)參考方案21版》中規(guī)定了紙片擴(kuò)散法及最低抑菌濃度稀釋法對各類細(xì)菌的敏感(Sensitive)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)藥敏判別標(biāo)準(zhǔn);CLSIM27-A3《酵母的肉湯稀釋法抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方案》中規(guī)定了假絲酵母屬(Candidaspp.)及部分真菌的敏感(Sensitive)、劑量依賴型敏感(Sensitive-dosedependent)、中介(Intermediate)、抗性(Resistant)藥敏判別標(biāo)準(zhǔn)。對于產(chǎn)孢絲狀真菌,由于研究進(jìn)展較緩慢,研究菌株的試驗(yàn)數(shù)據(jù)量較少,目前CLSI還未提出判別標(biāo)準(zhǔn),僅對臨床常用的幾種藥物給出了建議判別標(biāo)準(zhǔn),但根據(jù)M38-A2方法可以得到相關(guān)MIC值,MIC值對于菌株的藥物敏感性能描述也是重要的指征,并為今后判別標(biāo)準(zhǔn)的提出積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本試驗(yàn)參照M38-A2方案步驟對試驗(yàn)菌株進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)，所得MIC值結(jié)果基本相同,驗(yàn)證了M38-A2方案對于產(chǎn)孢絲狀真菌藥敏性能檢測的可行性。CLSIM38-A2規(guī)定的培養(yǎng)溫度為35°C,該培養(yǎng)條件可以促進(jìn)產(chǎn)孢,但對于少數(shù)菌株培養(yǎng)條件可能存在差異,如供試菌株蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)在CLSI標(biāo)準(zhǔn)所述的35°C不生長,因此本試驗(yàn)采用25°C進(jìn)行培養(yǎng)及藥敏測試。另外,MIC值拐點(diǎn)的判讀應(yīng)以抑制菌體生長的最低濃度為標(biāo)準(zhǔn),不應(yīng)以pH值指示劑顏色的改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn),因?yàn)橛行┚臧殡S著代謝產(chǎn)酸帶來的顏色改變,而另外一些代謝不產(chǎn)酸的菌株就不會發(fā)生顏色改變。

4討論

對于產(chǎn)孢絲狀真菌的液基稀釋抗真菌藥敏試驗(yàn)參考方案,美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)于1998年了M38-P,于2002年更新為M38-A,于2008年更新為M38-A2。M38-A2被檢測真菌范圍為包括臨床常見侵襲真菌感染菌種的產(chǎn)孢絲狀真菌,不包括非產(chǎn)孢絲狀真菌,也不適應(yīng)于雙相真菌的酵母相。M38-A2與上一版比較,增加了棘白菌素類藥物最低有效濃度(MEC,minimaleffectiveconcentration)的判別標(biāo)準(zhǔn),增加了4種藥物的結(jié)果判讀及結(jié)果解釋,抗真菌藥物更新至14種,質(zhì)控及參考菌株更新至13株[3]等。本文選取了14種抗真菌藥物中的6種,該6種抗真菌藥物國內(nèi)有標(biāo)準(zhǔn)品提供,13株質(zhì)控菌株中的1株,該株質(zhì)控菌株國內(nèi)有保藏,其他抗真菌藥物及質(zhì)控參考菌株都需要引進(jìn),然而相應(yīng)的引進(jìn)費(fèi)用高昂、程序繁瑣,是目前建立標(biāo)準(zhǔn)化方法亟待解決的問題之一。目前產(chǎn)孢絲狀真菌抗藥物敏感性試驗(yàn)研究主要集中在臨床上[6],目的一般是研究開發(fā)具有廣譜抗真菌性能的藥物,或?qū)拐婢幬锏目咕V進(jìn)行監(jiān)測[4,711]。以應(yīng)用于保健食品的真菌為研究對象,測定其對不同抗真菌藥物的敏感性,國內(nèi)還未見報道,一方面也顯示了國家政策文件與相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)或方法不配套、不同步的矛盾。本研究期望對相關(guān)檢測方法的建立提供部分技術(shù)依據(jù),但由于受試菌株數(shù)量少,無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,未來需要更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累,以獲得菌株耐藥敏感性的判別標(biāo)準(zhǔn),最終服務(wù)于廣大保健食品生產(chǎn)企業(yè)及檢測機(jī)構(gòu)。