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本文作者：王航、孟春、石賢愛(ài)、郭養(yǎng)浩單位：福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院、福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2-苯乙醇(2-Phenylethanol,PEA)是一種具有玫瑰香味的高級(jí)醇,香味淡雅細(xì)膩,香氣輕柔甜和,在醫(yī)藥、食品、化妝品、煙草和日化用品等行業(yè)逐漸得到廣泛應(yīng)用,成為芳香族化合物中最重要的香料品種。天然PEA香味純正,無(wú)不良副產(chǎn)物,日益受到消費(fèi)者青睞,其市場(chǎng)價(jià)格遠(yuǎn)高于化學(xué)合成的PEA[1]。利用酵母催化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成PEA是工業(yè)化生產(chǎn)天然PEA的有效途徑。目標(biāo)產(chǎn)物PEA對(duì)酵母的抑制效應(yīng)遠(yuǎn)大于副產(chǎn)物乙醇,是PEA生物合成過(guò)程主要瓶頸。了解PEA對(duì)酵母的脅迫機(jī)制及酵母的抵抗機(jī)理有助于深化對(duì)酵母合成PEA過(guò)程的認(rèn)識(shí),為解除PEA抑制效應(yīng)提供依據(jù)。有機(jī)溶劑對(duì)酵母細(xì)胞作用位點(diǎn)眾多,細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫作用的抵抗機(jī)制也十分復(fù)雜,至今仍未完全弄清楚。醇對(duì)酵母脅迫的研究多集中于乙醇,對(duì)PEA的研究較少見(jiàn)。流式細(xì)胞術(shù)可在單細(xì)胞水平對(duì)群體細(xì)胞進(jìn)行分析,具有分析速度快、靈敏度高、測(cè)量指標(biāo)多、信息量大等優(yōu)點(diǎn),是進(jìn)行細(xì)胞生理生化特性研究的有力工具。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)PEA作用后酵母細(xì)胞生理生化特性變化進(jìn)行研究,未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文研究在不同濃度PEA作用下,酵母分解代謝能力、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜滲透性、胞內(nèi)ROS濃度、線粒體膜電位、關(guān)鍵酶基因的表達(dá)等生理生化特性的變化規(guī)律,為優(yōu)化PEA生物合成過(guò)程提供重要依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種:釀酒酵母R-UV3由本實(shí)驗(yàn)室選育[2]。1.1.2主要儀器:熒光定量PCR儀(ABIPrism7500),AppliedBiosystems公司;透射電鏡(JEM1010),JEOL公司;流式細(xì)胞儀(CoulterEpicsXL),BechmanCoulter公司;冷凍離心機(jī)(Z323K),Hermle公司。1.1.3主要試劑:碘化丙啶、羅丹明123和二氫乙啶(98%),Sigma公司;TRIZOL試劑,美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa公司;熒光定量PCR試劑盒(SYBRGreen),AppliedBiosystems公司。1.1.4培養(yǎng)基:①種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨20.0,酵母浸粉10.0,pH5.0;②糖代謝測(cè)試培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,KH2PO41.0,脲2.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0;③分批轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60.0,KH2PO41.0,脲1.0,L-Phe10.0,MgSO40.3,CaCl20.2,pH5.0。

1.2方法

1.2.1種子培養(yǎng):從斜面接種至裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30°C下250r/min振蕩培養(yǎng)1214h至對(duì)數(shù)期。

1.2.2酵母PEA處理方法:收集對(duì)數(shù)期酵母種子,以0.6%(干重)接種量接入裝有25mL分批轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,30°C、250r/min振蕩培養(yǎng)18h,離心收集菌體,無(wú)菌水洗滌2次后,轉(zhuǎn)接入裝有25mL含PEA培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,每小時(shí)補(bǔ)加0.25g葡萄糖溶液(50%,W/W),30°C、250r/min培養(yǎng)24h。

1.2.3糖代謝保留值測(cè)定:見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.2.4碘化丙啶染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細(xì)胞,用PBS洗滌2次后稀釋至107個(gè)細(xì)胞/mL,取100μL細(xì)胞加1μL2.5mg/L的碘化丙啶,37°C避光孵育50min,加900μLPBS,混勻,流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)光488nm,FL3檢測(cè)器測(cè)605635nm發(fā)射光強(qiáng)度),計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。

1.2.5二氫乙啶染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細(xì)胞,用PBS洗滌2次后稀釋至107個(gè)細(xì)胞/mL,取100μL細(xì)胞加900μL含0.01%十四烷基三甲基溴銨的PBS和1μL30mg/L的二氫乙啶,37°C避光孵育30min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)光488nm,FL3檢測(cè)器測(cè)605635nm發(fā)射光強(qiáng)度),計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。1.2.6羅丹明123染色:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細(xì)胞,用PBS洗滌兩次后稀釋至107個(gè)細(xì)胞/mL,取100μL細(xì)胞加900μLPBS和2μL1mg/L的羅丹明123,37°C避光孵育20min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)光488nm,FL1檢測(cè)器測(cè)505545nm發(fā)射光強(qiáng)度),計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。

1.2.7透射電鏡觀察:離心收集經(jīng)PEA處理24h的酵母細(xì)胞,每107個(gè)細(xì)胞加入1mL的4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定液,4°C下固定3d后,委托福建醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)室制成50nm薄切片,使用透射電鏡進(jìn)行觀察,電壓80kV。

1.2.8aro10基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè):取1mL酵母細(xì)胞(約108個(gè)),離心去上清,加入1mL1%蝸牛酶液和20μL5%二硫蘇糖醇溶液,37°C振蕩脫壁30min。4°C、1000×g離心10min去除上清液,加入1mLTRIZOL試劑,按文獻(xiàn)[3]提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將提取到的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用SYBRGreen試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),PCR引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表2。每個(gè)樣品做4個(gè)重復(fù)樣,以actin為內(nèi)對(duì)照,ΔCt=aro10的平均Ct–actin的平均Ct;以不加L-Phe組為陰性對(duì)照,ΔΔCt=樣品組ΔCt–不加L-Phe組ΔCt,以2ΔΔCt表征aro10基因的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與討論

2.1PEA對(duì)酵母糖代謝活性的影響分解代謝是細(xì)胞生理活動(dòng)的基礎(chǔ)。酵母細(xì)胞的糖代謝活性可表征其生理生化狀態(tài)及生物活性。測(cè)定了外加不同濃度PEA作用24h后酵母的糖代謝保留值,結(jié)果見(jiàn)圖1。酵母糖代謝保留值隨PEA濃度增加而降低,在PEA濃度超過(guò)2.4g/L后,下降趨勢(shì)變得更加顯著,PEA濃度大于3.0g/L后,下降趨勢(shì)又有所趨緩。在4.0g/LPEA作用后,糖代謝保留值仍有0.43,說(shuō)明此時(shí)酵母還未完全死亡,仍有分解代謝能力。

2.2PEA對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響酵母分別經(jīng)0、2.7和4.0g/LPEA作用24h后,切片做透射電鏡觀察(圖2)。圖2A是未經(jīng)處理的酵母細(xì)胞,其細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)界限清晰,內(nèi)部結(jié)構(gòu)完好可見(jiàn),外形圓滑。圖2B是經(jīng)2.7g/LPEA作用的酵母細(xì)胞,與圖2A所觀察到的細(xì)胞無(wú)明顯差別。圖2C和2D是經(jīng)4.0g/LPEA作用的酵母細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得模糊不清,細(xì)胞質(zhì)染色明顯變淺,可能是因?yàn)榧?xì)胞膜滲透性增強(qiáng),胞內(nèi)物質(zhì)大量外漏。

2.3PEA對(duì)細(xì)胞膜滲透性的影響細(xì)胞膜是隔離胞內(nèi)外物質(zhì)的天然屏障,細(xì)胞膜滲透性的增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)重要物質(zhì)泄露,從而使細(xì)胞失去活性[4]。以碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)為染色劑,用流式細(xì)胞儀測(cè)定了經(jīng)不同濃度PEA作用24h后細(xì)胞膜滲透性的變化,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,當(dāng)外加PEA濃度小于0.8g/L時(shí),絕大多數(shù)酵母細(xì)胞的熒光值小于1,未被PI滲透,說(shuō)明絕大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜完好。隨著外加PEA濃度增加,熒光值大于1的細(xì)胞越來(lái)越多,說(shuō)明越來(lái)越多細(xì)胞的細(xì)胞膜受到破壞。特別是當(dāng)外加PEA濃度由2.4g/L增加到3.0g/L,被PI滲透的酵母明顯增加,而且熒光值較高的細(xì)胞也明顯增多,說(shuō)明細(xì)胞膜受損的程度明顯加大。當(dāng)PEA濃度大于3.0g/L后,在較弱的熒光區(qū)域分化出一個(gè)小峰,說(shuō)明細(xì)胞群體產(chǎn)生了分化。

2.4PEA對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。ROS濃度過(guò)高,會(huì)氧化核酸、蛋白質(zhì)、脂肪等生物大分子,使其失去生物功能,從而抑制細(xì)胞活性。當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時(shí),可能產(chǎn)生大量的ROS,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。以氫乙啶(Dihydroethidium,DHE)為染色劑,用流式細(xì)胞儀測(cè)定了經(jīng)不同濃度PEA作用24h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,隨著PEA濃度增加,產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸增加,同時(shí)峰形也向熒光值高的方向偏移,說(shuō)明越來(lái)越多細(xì)胞的ROS濃度增加了。PEA濃度從1.6g/L增加到2.4g/L時(shí),ROS急劇增加,PEA超過(guò)3.0g/L后,ROS濃度反而下降,這可能是由于細(xì)胞受到越來(lái)越大的傷害,產(chǎn)生ROS的能力反而下降。

2.5PEA對(duì)線粒體膜的影響線粒體是真核細(xì)胞中的重要細(xì)胞器,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。線粒體功能在增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)乙醇耐受性上起十分重要的作用[6]。以羅丹明123(Rhodamine123,RH123)為探針,用流式細(xì)胞儀測(cè)定經(jīng)不同濃度PEA作用后酵母細(xì)胞線粒體膜電位,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,隨著PEA濃度增加,在熒光值較高區(qū)域逐漸出現(xiàn)新細(xì)胞峰,峰的數(shù)量也逐漸增多,說(shuō)明細(xì)胞種群呈分化趨勢(shì),特別是PEA超過(guò)3.0g/L后,出現(xiàn)了幾個(gè)熒光值較高的峰,細(xì)胞種群明顯分化。當(dāng)PEA度超過(guò)3.5g/L后,高熒光值細(xì)胞急劇增多,說(shuō)明大量細(xì)胞線粒體膜電位顯著增大。線粒體膜電位增大說(shuō)明泵出線粒體膜的質(zhì)子多于流回基質(zhì)的質(zhì)子,而質(zhì)子的泵出在分解代謝過(guò)程產(chǎn)生,質(zhì)子的流入由合成代謝介導(dǎo),因而線粒體膜電位增大反映分解代謝水平超過(guò)合成代謝,二者解偶聯(lián)。Stark等[7]觀察到隨著外加PEA濃度的升高,細(xì)胞比耗氧速率增加,而細(xì)胞對(duì)糖得率卻下降,從動(dòng)力學(xué)角度為PEA導(dǎo)致細(xì)胞分解代謝和合成代謝解偶聯(lián)提供了證據(jù)。許多研究表明,細(xì)胞線粒體膜電位升高往往導(dǎo)致ROS濃度升高[8]。

2.6PEA對(duì)aro10基因表達(dá)的影響苯丙酮酸脫羧酶是L-Phe生成PEA途徑中的關(guān)鍵酶之一,aro10是釀酒酵母中編碼苯丙酮酸脫羧酶的主要基因[9]。將酵母細(xì)胞在含1%L-Phe的PEA培養(yǎng)基培養(yǎng)3h后,測(cè)定aro10基因相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果見(jiàn)圖6。PEA的加入降低了aro10的表達(dá),在PEA濃度達(dá)到2.4g/L后表達(dá)水平急劇下降,PEA濃度超過(guò)3.0g/L,aro10的表達(dá)逐漸回到不加L-Phe的水平。aro10相對(duì)表達(dá)量隨外加PEA濃度的變化關(guān)系與qPhe隨PEA濃度的變化趨勢(shì)[10]很相似,可見(jiàn),PEA抑制L-Phe轉(zhuǎn)化的重要機(jī)理之一,是PEA抑制aro10基因的轉(zhuǎn)錄。由于苯丙酮酸脫羧酶受L-Phe誘導(dǎo),因而PEA導(dǎo)致aro10基因表達(dá)水平下降的原因可能是PEA抑制了L-Phe的攝入。綜上,當(dāng)PEA濃度由2.4g/L增加到3.0g/L,R-UV3酵母的分解代謝能力、細(xì)胞膜滲透性、aro10基因表達(dá)水平等生理生化特性都發(fā)生較為顯著的變化,從而導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化活性急劇下降[10]。從補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化過(guò)程[10]來(lái)看,當(dāng)反應(yīng)液中PEA濃度超過(guò)3.0g/L后,PEA的增長(zhǎng)明顯變慢,也印證了這一敏感區(qū)間的存在。PEA對(duì)酵母細(xì)胞作用規(guī)律的研究結(jié)果不僅具有理論意義,而且對(duì)實(shí)施產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移(InSituProductRemoval,ISPR)過(guò)程中水相PEA濃度控制具有實(shí)際指導(dǎo)作用。在ISPR過(guò)程中,通過(guò)有效控制水相PEA濃度,可令酵母細(xì)胞保持較大的催化活性,從而提高時(shí)空得率。根據(jù)本文研究結(jié)果,ISPR過(guò)程水相PEA濃度可考慮控制在2.43.0g/L。