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【摘要】戊型肝炎(HepatitisE,HE)是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的經(jīng)消化道傳播的急性傳染病，發(fā)病率逐年升高，目前尚無特效治療方法，也無特異性被動和主動免疫制劑可供預(yù)防。在急性戊型肝炎患者中，血液或糞便中HEVRNA持續(xù)時間較短，操作復(fù)雜、成本高，不能在臨床廣泛開展。HE的診斷主要依靠血清HEV抗體檢測，抗-HEVIgM是HE急性感染的診斷指標之一，類風濕因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性?？?HEVIgG一般在發(fā)病2周后可檢測到，可持續(xù)1年甚至數(shù)年，因此抗-HEVIgG不能鑒別患者為HEV急性感染還是既往感染。有研究表明抗-HEVIgA是HE的急性指標，可代替或輔助現(xiàn)有IgM診斷試劑用于HE診斷，既增加了檢測特異性，又能有效減少漏診。

關(guān)鍵詞】戊型肝炎；戊型肝炎病毒；抗-HEVIgM；抗-HEVIgA；抗-HEVIgG

HE是由HEV引起的經(jīng)消化道傳播的急性傳染病，發(fā)病率逐年升高。有研究表明HEV還可通過血液途徑傳播[1]，而且最近發(fā)現(xiàn)HE在器官移植患者中可以慢性化[2]。HEV流行廣泛，呈全球性分布，主要累及衛(wèi)生條件差的亞洲、非洲和中美洲等地區(qū)中的發(fā)展中國家，在西方發(fā)達國家也有散發(fā)病例報道，在未暴發(fā)HEV的地區(qū)人群可檢測到抗HEV抗體。在某些發(fā)展中國家，HE占成人急性病毒性肝炎的50%以上，盡管只有1%～3%的患者發(fā)展為致死性急性肝炎，病死率為2.5％，明顯高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎，孕婦感染后病死率可高達20%。我國曾發(fā)生11次HE的暴發(fā)或流行，是HE高發(fā)區(qū)之一，1986年至1988年新疆發(fā)生迄今為止規(guī)模最大的HE暴發(fā)性流行，約有12萬人感染[3]。據(jù)衛(wèi)生部的傳染病疫情公示，近年來我國HE發(fā)病數(shù)呈現(xiàn)連續(xù)增長的態(tài)勢，死亡率也在逐年增加，已經(jīng)被列為因HE發(fā)病和死亡而引起的經(jīng)濟負擔最為嚴重的國家之一。

HEV是一個近似球形的二十面體顆粒，表面有突起和刻缺，形似杯狀，無包膜，平均直徑為32～34nm。HEV對高鹽、氯化銫、氯仿等敏感，在70℃～80℃中易裂解，在液氮中穩(wěn)定。HEV的基因組是一單股、正鏈RNA分子，全長約7.5kb，由5′端非編碼區(qū)(NCR)、非結(jié)構(gòu)區(qū)(NSR)、結(jié)構(gòu)區(qū)(SR)、3′端NCR和3′端Poly(A)尾巴組成，5′端NCR和3′端NCR之間為編碼區(qū)，包含3個開放讀碼框(ORF1、ORF2和ORF3)。ORF1主要編碼與HEV復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶、RNA解鏈酶及RNA聚合酶。ORF2編碼病毒衣殼蛋白，為主要的結(jié)構(gòu)基因編碼區(qū)。ORF3位于ORF1和ORF2之間，與ORF1和ORF2有部分重疊，編碼病毒特異性的免疫反應(yīng)抗原。作為一種單鏈RNA病毒，HEV基因組與蛋白質(zhì)容易發(fā)生變異，根據(jù)HEV核苷酸序列同源性比較的結(jié)果，目前至少可以將HEV分成4個主要的基因型和多個亞型?；蛐?：包括3個亞型，分別以HEV緬甸株(1a型)、巴基斯坦株(1b型)和摩洛哥株(1c型)為代表，以往以中國新疆株為代表的中國HEV與巴基斯坦株屬同一亞型；基因型2：以HEV墨西哥株為代表；基因型3：由美國株及大多數(shù)豬HEV組成；基因型4：包括新近發(fā)現(xiàn)的HEV中國株和臺灣株[3-4]。ORF2蛋白在已發(fā)現(xiàn)的HEV基因型中最為保守，具有很強的免疫原性，其編碼的氨基酸序列的同源性并不完全一致，第3型和第4型之間達94.6％，顯示了在種系進化上3、4兩型間的氨基酸序列相近，可能含有共同的抗原表位。第1型和第2型之間的氨基酸序列同源性達92.2％～92.8％。流行病學資料報道以往我國HE發(fā)病以1型毒株為主要病原體，近期的研究報告顯示4型HEV是目前引起我國散發(fā)性HE的主要病毒株[4]。

HE是一種嚴重危害人類健康的全球性疾病，目前尚無特效治療方法，也無特異性被動和主動免疫制劑可供預(yù)防。早期診斷，不僅對于患者的治療和改善預(yù)后具有重要意義，還可以及早發(fā)現(xiàn)具有傳染性的HE患者，準確評判HE急性感染、亞臨床感染、既往感染，對臨床處理及預(yù)后判斷有重要意義。做到及早隔離傳染源，防止病毒污染水源和食物，造成大規(guī)模暴發(fā)流行。

1HEVRNA、抗-HEVIgA、抗-HEVIgM和抗-HEVIgG與HE的關(guān)系

1.1HEVRNA與HE的關(guān)系

HE潛伏期平均4～6周，在出現(xiàn)臨床癥狀之前或同時即有糞便排毒和病毒血癥，然后才出現(xiàn)肝損害，血清HEV抗體在起病前1周左右開始升高，HEVRNA在血清或糞便中出現(xiàn)較早，HEVRNA的檢測是HE確診的指標，但大多數(shù)患者的病毒血癥持續(xù)時間較短，平均約為2周，病毒載量低，所以檢出率較低，故RT-PCR法檢測HEVRNA陰性的病例不能排除HE。鑒于PCR結(jié)果受標本采集時間的限制，而且PCR操作復(fù)雜、成本高、易受污染、會造成誤診或漏診，因此不宜作為常規(guī)檢測項目在臨床廣泛開展[5]。

1.2抗-HEVIgM與HE的關(guān)系

目前HE的診斷主要依靠血清HEV抗體檢測，抗-HEVIgM是HE急性感染的診斷指標之一[6-7]，在感染HEV第2周就可以在血清中被檢測到，第6周達到高峰，隨后迅速下降，陽性持續(xù)時間較短(3個月左右)。而且抗-HEVIgM現(xiàn)有診斷試劑常有漏診和誤診。眾所周知，類風濕因子等的存在會影響血清IgM的檢測，造成假陽性，這在其他疾病檢測中屢見不鮮，抗-HEVIgM檢測也不例外[8-9]。而抗-HEVIgM檢測也常常有假陰性報道，Nicand等[5]在抗-HEVIgM陰性的HE亞臨床感染患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒血癥和糞便排毒；Mitsui等[10]也報道在醫(yī)療工作人員系列血清追蹤調(diào)查中，HE亞臨床型感染患者出現(xiàn)短暫病毒血癥，而IgM檢測持續(xù)陰性；Gotanda等[11]報道了在谷丙轉(zhuǎn)氨酶明顯升高的獻血員中，出現(xiàn)HEV病毒血癥卻無IgM反應(yīng)性，等等。最近，Zhao等[9]又發(fā)現(xiàn)在11例HEV抗原陽性的HE患者血清中，抗-HEVIgM陰性。這部分漏診的帶毒者即成為HEV的移動傳染源，有可能是造成HE區(qū)域性小規(guī)模流行和持續(xù)散發(fā)的原因。這說明現(xiàn)有的IgM診斷試劑尚不能滿足HEV感染的臨床診斷和流行病學篩查與防治的需要。

1.3抗-HEVIgG與HE的關(guān)系

抗-HEVIgG一般在發(fā)病2周后可檢測到，在第7周達到高峰，并能一直保持在較高的水平，至少可持續(xù)1年甚至數(shù)年，因此抗-HEVIgG不能鑒別患者為HEV急性感染還是既往感染[8,12]。有研究表明IgG抗體親和力高低測定可診斷是否為急性感染。通常感染初期IgG親和力低，恢復(fù)期IgG親和力高，但重復(fù)感染患者通常也表現(xiàn)為IgG親和力高。這種情況在孕婦弓型蟲感染患者中也有報道。雖然抗體親和力能用來區(qū)分感染時間，特別是亞臨床和無黃疸的患者，也可以鑒定抗-HEVIgM陰性的急性感染，但高和低親和力的區(qū)分不得不憑經(jīng)驗，而且不是所有急性感染都是抗-HEVIgG親和力都低，也有的患者發(fā)病早期抗-HEVIgG陽性，而親和力高，因此抗體親和力實驗只能作為一種驗證實驗[13]。

1.4抗-HEVIgA與HE的關(guān)系

IgA作為免疫球蛋白中一個重要的成員，在黏膜免疫中起著重要的作用。認為可以作為外部屏障作用阻止病毒吸附到黏膜上皮細胞，同時攔截正在感染上皮細胞的病毒，并通過分泌作用將截獲的病毒送回到上皮細胞外，已經(jīng)證實在脊灰病毒、漢坦病毒等感染中，IgA發(fā)揮不容忽視的作用[14-15]。EBV-VCA-IgA的檢測已被公認是鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、預(yù)后監(jiān)測及大規(guī)模普查的敏感、可靠、簡便的方法，是提高鼻咽癌早期確診率的有效途徑[16]。IgA抗體被證實在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作為早期診斷的標志。

在大部分HEV早期感染患者中，可檢測到抗-HEVIgM和抗-HEVIgA陽性，但抗-HEVIgA陽性持續(xù)時間比抗-HEVIgM長，平均約為(120±23)d，對HEV感染的早期診斷更有意義[8]。早在1993年Chau等[17]就發(fā)現(xiàn)血清抗-HEVIgA與IgM同步升高，在恢復(fù)期消失，可以作為HEV急性期的感染指標。近年來越來越多的研究證實了這種觀點[18-19]，IgA作為HEV急性診斷指標的研究越來越受到人們的重視。Takahashi等[20]在豬感染HEV的研究中發(fā)現(xiàn)，抗-HEVIgA與病毒血癥的相關(guān)性遠遠高于抗-HEVIgM，提示抗-HEVIgA可以指示排毒。而且有些急性感染的患者沒有ALT的升高，會有短期的病毒血癥，抗-HEVIgG陽性，抗-HEVIgM陰性，卻可以檢測到抗-HEVIgA陽性，類似情況在脊髓灰質(zhì)炎病毒、漢坦病毒引起的病例中也有過相關(guān)報道[14-15]。有研究表明抗-HEVIgA是HE的急性指標，可代替或輔助現(xiàn)有IgM診斷試劑用于HE診斷，既增加了檢測特異性，又能有效減少漏診[19-21]。

2抗-HEVIgA的檢測方法

2.1蛋白印跡試驗檢測抗-HEVIgA

有文獻報道用蛋白印跡試驗檢測抗-HEVIgA[22]，這種方法具有靈敏度高、特異性好的特點，可用作HE患者的確證試驗。但這種方法操作復(fù)雜，耗時較長，影響因素較多，不適合在臨床上廣泛開展。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗-HEVIgA的方法，具有靈敏、快速、操作簡便、費用較低的優(yōu)點，操作中可用較少的人力快速處理大批量血清標本，檢測結(jié)果既可直接用肉眼定性判斷，也可借助酶標儀精確定量讀數(shù)，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，結(jié)果客觀可靠，還可借助全自動酶免分析儀使操作過程實現(xiàn)自動化、標準化，適合臨床常規(guī)檢測，是目前HE實驗室輔助診斷方法的研究熱點。本文由中國論文聯(lián)盟收集整理。

2.2HEVIgA間接法ELISA

目前文獻報道檢測抗-HEVIgA多用間接法ELISA，其原理是將用已包被抗原與特異性IgM、IgG、IgA結(jié)合，由于患者血清中存在大量的抗-HEVIgG、抗-HEVIgM與抗-HEVIgA競爭結(jié)合位點，從而敏感性降低，須通過去除抗-HEVIgG和抗-HEVIgM來提高其敏感性[9]。同時因間接法所包被抗原采用基因1型或2型HEV重組蛋白或合成肽抗原，有研究表明，用第1、2基因型多肽做抗原對檢測第3和4基因型感染患者的抗-HEVIgG、抗-HEVIgM和抗-HEVIgA時，其反應(yīng)不敏感[23]。最近，Bendall等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以HEV第1、2基因型抗原建立的ELISA診斷試劑在檢測英國本土HEV第3基因型感染的患者血清時，急性期HEV抗體檢出率可達95%，而半年后檢出率僅為12%。Herremans等[22]則發(fā)現(xiàn)以HEV第1、2型抗原檢測HEV第1型感染，檢出率為100%，而檢測第3基因型毒株感染時，檢出率僅為67%(ELISA)和57%(immunoblotassay)。由于HEV具有多基因型的特征，不同基因型抗原和感染不同基因型HEV患者血清反應(yīng)時會出現(xiàn)抗原抗體結(jié)合的差異，這是導(dǎo)致一些檢測方法漏檢的主要原因。因此建立高靈敏度和特異性的ELISA檢測方法需要使用具有廣泛反應(yīng)性的抗原，尤其是對我國這樣存在多基因型HEV感染的國家以及地區(qū)進行臨床診斷和流行病學篩查[4]。

3抗-HEVIgA檢測需要解決的問題

抗-HEVIgA抗體被證實在HEV急性感染期升高，可以作為早期診斷的標志，已經(jīng)越來越被認可和重視。目前國內(nèi)外還沒有抗-HEVIgA診斷試劑盒正式上市，雖然檢測抗-HEVIgA方法已經(jīng)有了很大的進展，但還存在很多問題：①因各種檢測方法采用的抗原不盡相同，因此敏感性差。最早對HEV的研究表明，HEV基因型按地理位置分布，一個地方只存在一種基因型，但是隨著新的HEV毒株不斷被發(fā)現(xiàn)，同一個地區(qū)可以存在兩種及以上的基因型。隨著與經(jīng)濟發(fā)展相適應(yīng)的全球人員流動性的增加以及HEV研究的深入，HEV基因型的地域分布特征已經(jīng)并將繼續(xù)發(fā)生重要改變。這種情況下，使用多基因型混合抗原建立酶聯(lián)免疫檢測方法，可以大大減少漏診率。②因為抗IgA與IgA不同片段結(jié)合位點的差異，導(dǎo)致檢測方法的敏感性也會有較大差異，選擇與IgA反應(yīng)性高的抗IgA單克隆抗體，可提高抗-HEVIgA檢測的敏感性和特異性[17]。③IgA可以從黏膜中分泌，故如能取唾液進行檢測，不僅方便而且減輕患者痛苦，值得進一步研究。④在免疫球蛋白缺乏癥患者中，HEV近期感染者其抗-HEVIgA可能表現(xiàn)為陰性。⑤通過血液傳播的患者可逃避黏膜免疫，IgA很低甚至沒有。

4抗-HEVIgA檢測前景展望

目前，對抗-HEVIgA的診斷價值也越來越重視，研制具有高特異性和敏感性的診斷試劑盒具有十分重要的意義。目前IgA類抗體檢測方法除了蛋白印跡試驗檢測，間接法ELISA外，捕獲法ELISA也有較好應(yīng)用，如冠狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等的IgA抗體的檢測[14-24]。其原理是首先將高特異性的抗人IgAα鏈McAb包被于微孔板，專一地捕獲血清中的IgA，不與IgM、IgG或其他種類的免疫球蛋白結(jié)合，然后抗原特異性IgA抗體與酶標抗原結(jié)合，再加入底物液顯色。目前IgA捕獲法ELISA在HEV抗體檢測中還沒有相關(guān)報道，但張?zhí)m芳等[25]已成功建立了基于多基因型HEV混合抗原的IgM抗體捕獲法ELISA。該法與間接法ELISA相比，前者陰性本底很低，陰性和陽性結(jié)果區(qū)別更加明顯，便于結(jié)果的判斷，所用的酶標抗原是不同基因型和亞型混合抗原，抗原性穩(wěn)定，共同抗原表位在不同基因型之間可誘發(fā)交叉中和反應(yīng)，能檢測出來源于不同國家和地區(qū)的血清標本，具有較為廣泛的血清反應(yīng)性，漏檢的機會少，敏感性高。HEVIgM捕獲法ELISA的建立及其他病毒IgA抗體捕獲法ELISA的建立為HEVIgA捕獲法ELISA的建立奠定了基礎(chǔ)。

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