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1材料與方法

病毒陽性病料從臨床患病豬的血清和肺臟中取樣，由本實驗室鑒定并保存。主要試劑及質(zhì)粒DNA提取和質(zhì)粒抽提試劑盒均購自天澤基因工程有限公司(北京);IPTG、Taq酶、dNTP、pMD18-T載體克隆試劑盒、T4DNAligase、各限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;蛋白質(zhì)Maker購自Fermentas公司;蛋白純化鎳柱購自公司;抗組氨酸抗體購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、ECL顯影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)及大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存。引物設(shè)計根據(jù)GenBank中收錄的豬博卡病毒基因組序列比對結(jié)果(登錄號為GU902967-GU902971)，利用DNAStar和Primer5．0軟件設(shè)計了用于擴(kuò)增豬博卡病毒vp2基因的特異性引物，在上游引物中引入BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點，在下游引物中引入XhoI限制性內(nèi)切酶位點，預(yù)計擴(kuò)增片段為795bp。引物序列為:上游引物;下游引物下劃線表示酶切位點)。引物由大連寶生物工程有限公司合成。病毒DNA提取及PCR擴(kuò)增取100mg陽性組織病料，加入1mlPBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，－20℃反復(fù)凍融3次，8000r/min離心10min，取上清液200μl，或取血清200μl進(jìn)行病毒DNA抽提，提取方法參照病毒DNA提取試劑盒說明書。以提取的DNA樣品為模板，擴(kuò)增體系為，模板DNA2.00μl，上、下游引物各1.00μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，用滅菌蒸餾水補(bǔ)充至50.00μl體系。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性個循環(huán);72℃延伸10min。原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定按DNA膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ分別酶切回收的PCR產(chǎn)物和pET32a(+)質(zhì)粒，切膠回收相應(yīng)片段后，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的固體LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，篩選出陽性質(zhì)粒，送大連寶生物工程有限公司測序。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS-PAGE分析將獲得的陽性重組質(zhì)粒(宿主菌BL21)按1%接種LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0．5～0.7時，加入IPTG至終濃度為100mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并分別在培養(yǎng)3h和5h時取1ml菌液，同時收集未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照，對經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21的空載體也以相同的條件誘導(dǎo)，作為對照。用12%的SDS-PAGE檢測重組蛋白。重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化誘導(dǎo)表達(dá)50ml重組菌，收集菌液，超聲裂解后，12000r/min離心20min后收集上清液，用鎳柱對融合蛋白進(jìn)行親和純化，將純化后的融合蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白的Westernblot鑒定對誘導(dǎo)5h的重組菌進(jìn)行Westernblot檢測鑒定。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，以抗組氨酸抗體為一抗，HRP酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體為二抗，加入ECL底物顯色液，室溫作用5～10min至顯色充分，用雙蒸水終止反應(yīng)，拍片觀察并保存。

2結(jié)果

對PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，對重組質(zhì)粒pET32a-VP2用BamHⅠ和XhoI進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，除載體片段外，還出現(xiàn)了795bp的條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果表明VP2序列與Gen-Bank中豬博卡病毒的VP2基因序列完全相同，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，與空載體pET32a(+)的菌液相比，重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在大小49000處出現(xiàn)一條較粗的蛋白條帶，大小與融合蛋白的理論值一致，隨著誘導(dǎo)時間的增加，其表達(dá)量也隨之增加。而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均沒有出現(xiàn)相同的條帶。擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集細(xì)菌，經(jīng)超聲破碎及離心分離沉淀和上清，分別進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示重組蛋白主要存在于上清中，表明蛋白表達(dá)產(chǎn)物以可溶性形式存在為主。進(jìn)一步利用鎳柱對其純化，得到一條大小49000的清晰條帶，與預(yù)期相符重組蛋白的表達(dá)、鑒定與純化重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-VP2在大腸桿菌BL212．

3表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot檢測

建立一種快速、敏感、簡便的血清學(xué)檢測方法成為當(dāng)務(wù)之急。本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-VP2，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了豬博卡病毒的VP2蛋白。結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白有很高的表達(dá)量，且以可溶性蛋白形式存在;經(jīng)過柱純化后，該蛋白純度較高;經(jīng)Westernblot鑒定，證明該蛋白具有很x好的反應(yīng)原性。目前研究結(jié)果都表明VP2蛋白可作為診斷抗原的候選蛋白。因此，本研究為進(jìn)一步深入研究豬博卡病毒VP2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)，同時為建立血清學(xué)診斷方法，如間接ELISA方法和膠體金免疫層析試紙條等提供了候選蛋白。

作者：李彬杜露平何孔旺單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院