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1材料與方法

實驗材料基因工程菌pRSET-N-BL21、PRRSV由動物醫(yī)學(xué)院傳染病組饋贈；兔抗PRRSV高免血清由本實驗室通過滅活的全病毒免疫后制備保存；偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（HCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）由本實驗室保存；DMEM、HAT及HT為美國GIBCO公司產(chǎn)品；PEG-1500及MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit為Roche公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季青公司；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由江蘇農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所饋贈；Balb/c小鼠、清潔級小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)。PRRSV核衣殼蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定將基因工程菌pRSET-N-BL21自然融化后接種于含氨芐青霉素(100μg/ml)的2×YT瓊脂平板上，37℃恒溫孵育18h。于2×YT瓊脂平板上挑取單菌落，接種到5ml含氨芐青霉素(100μg/ml)的2×YT液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。然后按1∶100的接種量進(jìn)行二次活化，200r/min，37℃搖床振蕩培養(yǎng)，菌體密度生長至對數(shù)期后。將各培養(yǎng)管按IPTG濃度梯度（1mmol/L、0.5mmol/L）和溫度梯度（37℃、30℃、20℃）誘導(dǎo)4h，所有管每隔1h取樣一次（每次0.5ml），將樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析確定最佳誘導(dǎo)條件。按優(yōu)化的最佳條件重新誘導(dǎo)表達(dá)，并于最佳時間取樣40ml經(jīng)超聲破碎后，分別取破碎后上清與沉淀，利用SDS-PAGE檢測表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量，表達(dá)形式，并利用Westernblot鑒定目的蛋白。隨后對該工程菌按最佳條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，采用His-Ni2+親和層析純化重組N蛋白，純化產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳鑒定。分泌抗高致病性PRRSVN蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立將純化的PRRSVN蛋白，常規(guī)法免疫、細(xì)胞融合制備單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。陽性雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性試驗雜交瘤細(xì)胞繼代培養(yǎng)6個月以上，定時用ELISA間接法測定培養(yǎng)上清抗體效價.分別復(fù)蘇凍存1個月，2個月，4個月，8個月和12個月的陽性雜交瘤細(xì)胞，用ELISA間接法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞誘生小鼠腹水的抗體效價。單抗的亞型鑒定按試劑盒說明書操作。雜交瘤細(xì)胞染色體分析取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)秋水仙堿、0.075mol/LKCl溶液處理，固定制片后染色，油鏡下觀察染色體并記數(shù)。單抗特異性鑒定將表達(dá)的PRRSVN蛋白以4μg/ml包被，以4G10單抗腹水及其它病毒，如偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（HCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的特異性多抗為一抗，用間接ELISA法檢測單抗特異性。

2結(jié)果

按該條件重新誘導(dǎo)N蛋白的表達(dá)并通過超聲破菌，經(jīng)結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)破菌比較徹底。將細(xì)菌裂解液離心后分別收集上清和沉淀重懸液，行SDS-PAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上清液中N蛋白的含量明顯高于沉淀中含量，說明在該條件下N蛋白主要以可溶性形式存在，包涵體中含量較少。將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物用兔抗PRRSV高免血清進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果顯示陽性，表明重組N蛋白成功表達(dá)。重組N蛋白經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過His-Ni2+親和層析純化帶有6His的融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，獲得的重組蛋白純度較高，但含有部分雜蛋白，也可能有少量的二聚體的形成抗高致病性PRRSVN蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立本實驗一次融合共分裝384孔，融合成功312孔，融合率達(dá)81.3％，ELISA初檢陽性率達(dá)17.3％；選擇陽性值較高的20個孔亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，不斷反復(fù)篩選得到了2株較穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4G10及2F9。融合后的雜交瘤細(xì)胞如圖3，細(xì)胞融合的篩選結(jié)果如表1所示。單抗的生物特性鑒定陽性雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性試驗4G10和2F9細(xì)胞株繼代培養(yǎng)6個月以上，其培養(yǎng)上清ELISA效價仍保持在1∶1024～1∶2048，分別凍存1、2、4、6個月后復(fù)蘇，其誘生腹水的Mabs效價仍保持在1∶25600～1∶51200之間雜交瘤細(xì)胞染色體分析對4G10和2F9細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞分裂相染色體形態(tài)進(jìn)行觀察，可見到端著絲點和中間著絲點，染色體數(shù)目介于100～110條之間，具有雜交瘤細(xì)胞染色體特征。單抗特異性鑒定將PRV、HCV、PPV特異性抗體和4G10小鼠腹水進(jìn)行梯度稀釋，分別與重組N蛋白包被的酶標(biāo)板進(jìn)行反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果表明：重組N蛋白與4G10單抗反應(yīng)較強(qiáng)烈，而與其它病毒抗體不反應(yīng)，說明所得到的單抗具有較好的特異性。

作者:吳勝昔邵烈剛單位：重慶理工大學(xué)