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1iPSC技術(shù)

經(jīng)典的iPSC技術(shù)路線主要包括以下步驟:①選擇宿主細(xì)胞;②選擇外源重組因子;③重組因子導(dǎo)入宿主細(xì)胞;④重編程產(chǎn)生iPSC;⑤iPSC的鑒定及分化。

1．1宿主細(xì)胞來源Yamanaka將小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC開啟了該技術(shù)的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊，甚至一些瀕危動物的iPSC系紛紛建立。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)成形細(xì)胞、羊水、神經(jīng)前體細(xì)胞、外周血細(xì)胞，甚至尿液中獲得iPSC。不同組織來源細(xì)胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩(wěn)定性和癌基因的表達(dá)方面也存在男女有別現(xiàn)象。使得iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床個體治療更具挑戰(zhàn)性。

1．2重組因子的選擇及導(dǎo)入方式經(jīng)典的Yamanaka因子在癌細(xì)胞中存在超表達(dá)、整合型載體可導(dǎo)致插入突變，且誘導(dǎo)效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡單、有效的誘導(dǎo)策略。Anokye-Danso等應(yīng)用微RNA調(diào)控技術(shù)，不使用轉(zhuǎn)錄因子高效誘導(dǎo)iPSC。Zhou等和Kim等分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉(zhuǎn)錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導(dǎo)受體細(xì)胞為iPSC，但效率較低。一些學(xué)者利用腺病毒、質(zhì)粒載體瞬時轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，或利用Cre/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNAI系統(tǒng)及piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現(xiàn)象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應(yīng)用可顯著提高iPSC的產(chǎn)生效率。

1．3iPSC的誘導(dǎo)分化Zhao等利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、耳蝸毛細(xì)胞、色素細(xì)胞等類型細(xì)胞。

1．4iPSC機制相關(guān)研究突破研究人員長期受困于體細(xì)胞重編程的具體機制。Polo等繪制出體細(xì)胞重編程為iPSC的分子線路圖，證實誘導(dǎo)過程引起了兩次轉(zhuǎn)錄波，分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅(qū)動，并確定了重編程過程中路障基因?；趇PSC技術(shù)已證明細(xì)胞的分化過程并非不可逆轉(zhuǎn)，研究人員利用細(xì)胞直接重編程技術(shù)將已分化細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成特定譜系的細(xì)胞，利用間接譜系轉(zhuǎn)化技術(shù)部分去分化生成多潛能祖細(xì)胞，為干細(xì)胞研究開辟了新思路。

2臨床應(yīng)用前景

iPSC因其分化全能性、體外易擴增、易于基因干擾或過表達(dá)等特性，在再生醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)評價、組織工程等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

2．1疾病特異iPSC動物疾病模型由于種屬差異，不能真實反映人類疾病，利用疾病特異的iPSC系建立的iPSC疾病模型則可彌補這一缺陷，還可在免疫缺陷動物體內(nèi)觀察疾病。當(dāng)前已建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮、唐氏綜合征、脆性X綜合征)，血液系統(tǒng)疾病(范科尼貧血、鐮刀細(xì)胞型貧血、β地中海貧血、原發(fā)性骨髓纖維化)，代謝系統(tǒng)疾病(1型糖尿病，Ⅲ型戈謝病，Shwachman-Bodian-Diamond綜合征、肌營養(yǎng)不良、萊施-奈恩綜合征)及其他疾病(右心室心肌病)等特異的iPSC系。

2．2藥物研發(fā)及篩選大規(guī)模藥物篩選需要很多細(xì)胞，iPSC可以無限增殖，并且疾病特異iPSC本身就是篩選藥物的目標(biāo)。Takayama等導(dǎo)入Foxa2及肝細(xì)胞核因子1α到人類ESC/iPSC產(chǎn)生具有代謝功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，對篩查藥物肝毒性具有重大意義。Lippmann等將iPSC轉(zhuǎn)化為血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物高通量篩選或藥物神經(jīng)毒性檢測。Egawa等利用肌萎縮側(cè)索硬化癥患者iPSC分化而來的神經(jīng)細(xì)胞來篩選并確認(rèn)藥物效果，發(fā)現(xiàn)漆樹酸具有改善神經(jīng)異常的作用。

2．3組織工程學(xué)應(yīng)用用干細(xì)胞培養(yǎng)的人體組織是理想的器官再造來源。英國已經(jīng)報道利用3D打印技術(shù)為癌癥患者重塑面部，F(xiàn)aulkner-Jones等將3D打印拓展到人ESC范圍，當(dāng)3D打印技術(shù)能夠兼容iPSC時，組織工程學(xué)將邁上一個新的臺階。

2．4臨床疾病治療

2．4．1神經(jīng)系統(tǒng)疾病帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，目前治療手段只能改善癥狀。Kikuchi等利用iPSC分化出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞，然后移植到帕金森病猴子腦部，這些細(xì)胞存活半年以上，并持續(xù)釋放多巴胺，很大程度上減輕了患病猴子的癥狀。Jiang等將帕金森病患者和健康志愿者皮膚細(xì)胞來源iPSC誘導(dǎo)為腦細(xì)胞并對比，觀察到parkin基因發(fā)生突變產(chǎn)生自由基破壞多巴胺神經(jīng)元是帕金森病發(fā)病機制之一。除帕金森病外，在阿爾茨海默病、脊髓側(cè)索硬化癥、脊髓肌肉萎縮癥及舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病研究中，iPSC也取得許多進(jìn)展。

2．4．2血液系統(tǒng)疾病Hanna等將人類鐮刀型貧血癥小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立的iPSC，通過同源重組技術(shù)獲得正?；蛐蚷PSC，誘導(dǎo)為造血干細(xì)胞并移植后可治療動物模型的鐮狀細(xì)胞性貧血。Xu等用iPSC來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞移植到血友病小鼠肝臟中，病鼠出血癥狀得到了改善。Raya等獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPSC，其能夠分化成表型正常的髓系和紅系造血祖細(xì)胞。最近，日本學(xué)者利用iPSC培養(yǎng)出一種能產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞，有望用于治療腎性貧血。

2．4．3心血管系統(tǒng)疾病2008年，Schenke-Layland等成功地將小鼠iPSC在體內(nèi)和體外分別誘導(dǎo)出了心肌細(xì)胞。之后，Nelson等將iPSC分化得到的心肌細(xì)胞移植入具有完整免疫系統(tǒng)的成年小鼠梗死心臟內(nèi)，能夠觀察到功能性的新生心肌。Tohyama等使用不含葡萄糖的低成本培養(yǎng)液獲得大量純度高達(dá)99%的心肌細(xì)胞，且?guī)缀醪淮嬖诎┗L(fēng)險。而Zhang等證實iPSC具有分化為心房、心室和竇房結(jié)細(xì)胞等的潛能。

2．4．4感官疾病感音神經(jīng)性聾的主要原因是毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變和死亡，而其治愈需要相關(guān)結(jié)構(gòu)的修復(fù)或再生。Nishimura等將iPSC來源神經(jīng)祖細(xì)胞移植到小鼠耳內(nèi)，觀察到這些神經(jīng)細(xì)胞開始表達(dá)谷氨酸神經(jīng)元的標(biāo)志性因子，表明iPSC可用于螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的再生修復(fù)。Oshima等使用小鼠ESC及iPSC成功分化出了功能性內(nèi)耳毛細(xì)胞。Mizutari等使用γ-分泌物抑制劑抑制Notch信號通路，刺激支持細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)胞，首次證明成熟哺乳動物的感音毛細(xì)胞也能再生。感音毛細(xì)胞的損傷導(dǎo)致聽力損失，感光細(xì)胞的損失則導(dǎo)致視力損失。Meyer等將iPSC分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成功治愈1例回旋狀脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮癥患者。Singh等將發(fā)育中的感光細(xì)胞移植到盲鼠眼睛中，能夠再次形成視網(wǎng)膜的整個光敏感層，恢復(fù)視覺。

2．4．5內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病Tateishi等將正常人iPSC培養(yǎng)成胰島素分泌型的胰島細(xì)胞，其不僅能分泌C肽和胰高血糖素，而且能通過感受葡萄糖的刺激來調(diào)節(jié)C肽的分泌。Maehr等用1型糖尿病患者的成纖維細(xì)胞來源iPSC分化出了具有胰島素分泌功能的細(xì)胞。這些研究使糖尿病患者特異細(xì)胞治療成為可能。

2．4．6生殖系統(tǒng)疾病Park等將iPSC體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞，其與體內(nèi)分離的原始生殖細(xì)胞在基因表達(dá)上極相似。Hayashi等將小鼠ESC和iPSC在體外誘導(dǎo)成為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞并分化為功能正常的精子和卵子。如果能進(jìn)一步將人原始生殖細(xì)胞體外分化為精子和卵子，就有望治療不孕不育癥。

2．4．7運動系統(tǒng)疾病杜氏肌營養(yǎng)不良是一種X染色體隱性遺傳病，患者早期即出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，嚴(yán)重威脅生命安全。Filareto等將杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠皮膚細(xì)胞重編程為了iPSC，進(jìn)行遺傳修復(fù)，再分化成骨骼肌干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，能產(chǎn)生功能性肌肉，并檢查到新形成的肌纖維表達(dá)修復(fù)后的標(biāo)記，證明了iPSC技術(shù)結(jié)合遺傳修復(fù)技術(shù)治療杜氏肌營養(yǎng)不良的可行性。Diekman等利用iPSC在小鼠實驗中培育出無再生能力的軟骨，有望成為人造軟骨組織的來源。

2．4．8腫瘤Chen等用小鼠iPSC培育出了癌癥干細(xì)胞，并確認(rèn)其發(fā)展成癌細(xì)胞的過程。Yang等發(fā)現(xiàn)人類iPSC來源的神經(jīng)干細(xì)胞可以靶向腫瘤，或可用于聯(lián)合基因治療，抑制腫瘤生長。Vizcardo等從惡性黑色素瘤患者體內(nèi)提取出T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)出iPSC再分化成為T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞能夠識別黑色素瘤特異性蛋白黑色素瘤抗原1，繼續(xù)攻擊癌細(xì)胞。此方法能夠大量培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，有望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出治療癌癥的新型免疫療法。

2．4．9其他人類疾病CCR5(C-Cchemokinereceptortype5)是人類免疫缺陷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的重要輔助受體，缺乏CCR5使人類免疫缺陷病毒不能感染人體。Yao等用鋅指核酸酶技術(shù)剔除患者iPSC的CCR5基因，并誘導(dǎo)成造血干細(xì)胞，為艾滋病的治療提供一條新的可能途徑。Arakaki等將小鼠iPSC與小鼠齒源性上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為成釉細(xì)胞，且含有作為牙釉質(zhì)成分的成釉蛋白，這對牙齒再生和修復(fù)研究至關(guān)重要。

3展望

iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床前必須確保其安全性。目前存在的主要問題:iPSC帶有自身表觀遺傳印記和端粒異常;與ESC相比存在少量基因異常表達(dá);誘導(dǎo)本身及傳代過程都可導(dǎo)致變異。而且自體iPSC移植回患者機體后會否引起免疫反應(yīng)一直存在著爭議。雖然存在各種疑惑和爭論，但iPSC技術(shù)潛力不可限量，隨著iPSC機制研究的進(jìn)展，許多問題將迎刃而解，種種困難并不能減退人們對iPSC技術(shù)的研究熱情，iPSC技術(shù)必將勢不可擋地推動醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

作者：馮睡安廣宇尹金淑單位：北京大學(xué)第九臨床學(xué)院首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院耳鼻咽喉科