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一、脫細(xì)胞支架制備方法

全器官脫細(xì)胞支架的制備是肝臟組織工程的基礎(chǔ)，通過(guò)利用物理、化學(xué)或酶解等方法去除細(xì)胞成分和遺傳物質(zhì)，獲得與原有器官相似的超微立體結(jié)構(gòu)和大部分細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，保留了完整的支架。1997年Cao等首次制造了人工耳，近年來(lái)脫細(xì)胞支架已運(yùn)用于心、肺和腎等器官的組織工程研究，結(jié)果表明，脫細(xì)胞方案的選擇與支架結(jié)構(gòu)及ECM成分密切相關(guān)，具有器官／組織特異性。目前，應(yīng)用于脫細(xì)胞支架制備的方法有很多，每種方法各有優(yōu)勢(shì)，其選擇取決于組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、密度、脂肪含量和厚度。為方便科技工作者選擇，對(duì)常用的脫細(xì)胞因子作如下簡(jiǎn)介。

1．化學(xué)因子（1）酸和堿：酸能水解生物大分子或催化其水解。過(guò)氧乙酸是一種常見(jiàn)的抗感染因子，對(duì)殘留的核酸具有很強(qiáng)的去除作用，而對(duì)ECM的影響較小；乙酸會(huì)破壞膠原成分，降低ECM的強(qiáng)度，而對(duì)硫酸鹽黏多糖的影響較小。堿因其完全去除了ECM中的生長(zhǎng)因子，嚴(yán)重影響其機(jī)械性能，基本只用于早期處理表皮的脫毛。

（2）低滲和高滲溶液：高滲溶液可以分離DNA和蛋白質(zhì)，低滲溶液可以溶解細(xì)胞。為發(fā)揮最大作用，經(jīng)常將低滲和高滲溶液交替使用，但此法耗時(shí)長(zhǎng)，處理后的組織易水腫，且不能完全溶解掉細(xì)胞殘余物，還需進(jìn)一步處理。

（3）洗滌劑：分為離子型、非離子型和兩性離子型洗滌劑。通過(guò)溶解細(xì)胞膜并將DNA從蛋白質(zhì)中分離，脫細(xì)胞效果明顯，然而這些洗滌劑會(huì)將ECM中的蛋白質(zhì)成分去除，蛋白質(zhì)的丟失程度隨著洗滌時(shí)間的增加而增加。多種洗滌劑同時(shí)使用會(huì)增加ECM蛋白的丟失，優(yōu)點(diǎn)是有利于脫細(xì)胞之后洗滌劑的去除。與酶相比，非離子型洗滌劑TritonX－100能夠更有效的從致密組織中去除細(xì)胞成分。離子型洗滌劑十二烷基磺酸鈉（SDS）相比于TritonX－100能更好的從致密的組織或器官中去除細(xì)胞核成分，同時(shí)保持其機(jī)械性能；在完全去除細(xì)胞核成分中起至關(guān)重要的作用，但是會(huì)引起一些超微結(jié)構(gòu)的破壞和生長(zhǎng)因子的丟失。兩性離子型洗滌劑3－［（3－膽固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸（CHAPS）對(duì)薄的組織（比如肺）作用較強(qiáng)，但是對(duì)于較厚的組織，即使與SDS聯(lián)合使用，脫細(xì)胞效果仍然很弱。需要注意的是，脫細(xì)胞之后必須將ECM中殘余的洗滌劑去除，特別是SDS，它能夠穿透入較厚和致密的組織，即使在較低濃度時(shí)仍對(duì)再種植的細(xì)胞顯示毒性。

（4）醇類(lèi)：甘油通過(guò)脫水和溶解細(xì)胞發(fā)揮作用；甲醇和乙醇能使蛋白質(zhì)沉淀，進(jìn)而破壞ECM的超微結(jié)構(gòu)。

2．生物因子（1）酶：能夠用于脫細(xì)胞的酶包括核酸酶、胰蛋白酶、膠原酶、脂肪酶、中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和α－半乳糖苷酶，去除細(xì)胞成分方面有較高的特異性。然而，用單一的酶來(lái)完全去除細(xì)胞成分難以達(dá)到預(yù)期的目的，且殘留的酶不利于細(xì)胞再種植，并且存在誘發(fā)不利免疫應(yīng)答的可能。核酸酶可以裂解核酸序列，可用于去除殘余的核苷酸。胰蛋白酶是一種常用的脫細(xì)胞因子，然而，ECM中的蛋白質(zhì)如膠原蛋白對(duì)胰蛋白酶的抵抗能力較弱，因此使用時(shí)應(yīng)格外小心。與洗滌劑相比，胰蛋白酶對(duì)彈性蛋白和膠原蛋白破壞力較大，脫細(xì)胞速度較慢，但能更好的保護(hù)糖胺聚糖。胰蛋白酶脫細(xì)胞效果及對(duì)ECM的影響程度與時(shí)間相關(guān)，單獨(dú)使用胰蛋白酶完整脫細(xì)胞需要很長(zhǎng)的時(shí)間。值得注意的是，胰蛋白酶可以破壞組織的超微結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)的脫細(xì)胞因子的滲透，因此在初始階段使用胰蛋白酶可以起到較好的作用，特別是要從一些致密的組織中完全去除細(xì)胞核。脂肪酶有協(xié)助去脂作用。中性蛋白酶的脫細(xì)胞效果較好，但會(huì)伴隨著ECM更大程度的破壞。（2）非酶因子：螯合物如乙二胺四乙酸（EDTA）和乙二醇雙（2－氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）有助于細(xì)胞從ECM蛋白中分離，但是，單獨(dú)使用螯合物即使通過(guò)振蕩也難以將表層細(xì)胞脫去。因此，它們經(jīng)常和酶（如胰蛋白酶）或者洗滌劑聯(lián)合使用。聯(lián)合使用螯合物與高／低滲溶液脫細(xì)胞的效果尚不明確。3．物理和其他因子（1）溫度：凍融技術(shù)能有效的溶解組織和器官中的細(xì)胞，對(duì)組織的超微結(jié)構(gòu)僅有輕微影響。單次凍融可以減少不利的免疫應(yīng)答，如白細(xì)胞浸潤(rùn)；應(yīng)用多次循環(huán)凍融對(duì)ECM蛋白的含量影響較小。（2）機(jī)械振蕩法和壓力：機(jī)械振蕩法可通過(guò)振蕩產(chǎn)生的能量破壞細(xì)胞，多與其他方法聯(lián)合使用，可將細(xì)胞從基底膜分離，然而不可避免的造成超微結(jié)構(gòu)和基底膜完整性的破壞。靜水壓力所需時(shí)間較短，在血管或者角膜組織脫細(xì)胞時(shí)的效果比洗滌劑或者酶更有效，但是冰晶的形成會(huì)影響ECM的超微結(jié)構(gòu)。（3）非熱力學(xué)打孔技術(shù)：使用微秒的電脈沖流經(jīng)組織或者組織中的剩余細(xì)胞，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞膜表面的微空隙，從而破壞細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境，繼而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于非熱力學(xué)打孔技術(shù)的探針較小，能用它來(lái)脫細(xì)胞的組織較小，應(yīng)用明顯受限。

二、脫細(xì)胞支架的滅菌

脫細(xì)胞支架制備成功后將進(jìn)行系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，在此之前對(duì)支架的滅菌十分重要，常使用去除熱原法來(lái)清除殘余的內(nèi)毒素、病毒和細(xì)菌DNA。生物支架可以置于酸或者其他溶劑中以達(dá)到滅菌的目的，但是該方法滲透能力不強(qiáng)，且會(huì)損傷重要的ECM成分；環(huán)氧乙烷對(duì)ECM的機(jī)械性能影響較大，并引起不利的免疫應(yīng)答，進(jìn)而影響移植后正常功能的發(fā)揮；γ射線、電子束輻射等滅菌方法會(huì)改變ECM的超微結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能；超臨界二氧化碳對(duì)ECM和支架的機(jī)械性能的影響較其他方法小，目前成為一種替代方法。

三、肝臟脫細(xì)胞支架的制備方法

脫細(xì)胞器官優(yōu)良的性能為其成功應(yīng)用于肝臟帶來(lái)希望。Shupe等首次報(bào)道了嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝臟的脫細(xì)胞，通過(guò)下腔靜脈置管，門(mén)靜脈切斷，上腔靜脈結(jié)扎，PBS去除血管內(nèi)剩余血液，依次用濃度為1％、2％、3％的TritonX－100各300ml以5ml／min的速度灌注肝臟，以含0．1％SDS的PBS液300ml沖洗。脫細(xì)胞肝臟經(jīng)HE染色，顯示完整的ECM網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；免疫組化染色表明Ⅳ型膠原和層黏連蛋白均保留，且膠原存在于基質(zhì)中，而層黏連蛋白存在于血管的基底膜中。將106個(gè)大鼠肝臟前體細(xì)胞WB344置于RPMI1640培養(yǎng)基中，通過(guò)置管的下腔靜脈注入肝臟進(jìn)行再種植，構(gòu)建出組織工程肝臟。另有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)門(mén)靜脈插管以1ml／min灌注梯度濃度的SDS（0．01％、0．1％、1％）各24h，用蒸餾水灌注15min、1％的TritonX－100灌注30min清除剩余的SDS。PBS沖洗1h后，從門(mén)靜脈注入染色劑可以清楚地觀察到完整的血管結(jié)構(gòu)。將其中一葉置于0．1％的過(guò)氧乙酸中滅菌。組織學(xué)分析顯示，在支架中幾乎無(wú)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)；免疫組化分析Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、β1層黏連蛋白，結(jié)果表明其在ECM的結(jié)構(gòu)和血管基底膜的完整性方面與正常肝臟相當(dāng)，DNA含量分析證實(shí)支架中DNA低于3％。大鼠來(lái)源的肝細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈以15ml／min灌入，3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)2周，分別于種植后4h、1、2、5d行組織染色，結(jié)果表明4h時(shí)，大多數(shù)細(xì)胞存在于血管內(nèi)或者血管周?chē)?d和2d時(shí)，細(xì)胞離開(kāi)血管，分布到基質(zhì)中。該文獻(xiàn)首次報(bào)道了將肝細(xì)胞種植到支架上后白蛋白分泌、尿素合成等功能的發(fā)揮，再種植成功的肝臟被移植到單側(cè)腎切除的大鼠體內(nèi)。Baptista等采用小鼠、大鼠、雪貂、兔和豬，分別經(jīng)由門(mén)靜脈插入不同尺寸的導(dǎo)管，通過(guò)蠕動(dòng)泵以5ml／min的速度注入總量約為40倍肝臟體積的蒸餾水，后以1％的Triton－X100和0．1％氨水灌注肝臟去除細(xì)胞，最后以蒸餾水去除殘余洗脫劑。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人胚胎肝細(xì)胞種植到肝臟支架中，同時(shí)通過(guò)門(mén)靜脈以3ml／min循環(huán)灌注RPMI1640培養(yǎng)基16h，首次證實(shí)了人肝細(xì)胞前體細(xì)胞具有在脫細(xì)胞肝臟支架上生存的潛力。功能測(cè)定顯示，培養(yǎng)液中的尿素和白蛋白水平明顯高于單純將人胚胎肝細(xì)胞置于培養(yǎng)液中的方法。另有文獻(xiàn)報(bào)道一種改良的脫細(xì)胞方法，以RPMI1640培養(yǎng)基灌洗10min，再用混有SDS的磷脂酶A2沖洗30－60min，直到組織透明，流出液澄清，再以高滲鹽水及核酸酶分別沖洗，直到灌洗液在280nm及260nm的吸光度皆呈陰性，最后以RPMI1640培養(yǎng)基沖洗2h，所制備支架具有將肝臟前體細(xì)胞分化成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的能力。然而，上述文獻(xiàn)都僅限于嚙齒類(lèi)動(dòng)物，Barakat等采用新的方法制備豬脫細(xì)胞支架，并進(jìn)行人肝細(xì)胞種植：以SDS進(jìn)行去細(xì)胞，右前葉作為種植細(xì)胞的支架，含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的胚胎肝細(xì)胞和胚胎星狀細(xì)胞作為種植細(xì)胞，灌注液中含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和其他所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)測(cè)量灌注過(guò)程中氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸、葡萄糖、尿素氮和白蛋白量進(jìn)行肝臟代謝和合成功能的評(píng)估。結(jié)果表明，再生的肝臟呈現(xiàn)活躍的代謝能力，并保留白蛋白的合成能力，種植細(xì)胞分化為成熟的肝細(xì)胞。因此，ECM對(duì)于細(xì)胞的種植至關(guān)重要，具有支持細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)前體細(xì)胞特異性分化的作用。Hammond等通過(guò)將肝臟脫細(xì)胞支架移植到正常肝臟和部分肝切除的肝臟中，證實(shí)了這一觀點(diǎn)。首要的觀察指標(biāo)為肝細(xì)胞DNA的合成和肝組織滲透進(jìn)入支架的程度；其次的觀察指標(biāo)為非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的DNA合成、肝重量的測(cè)定、肝功能測(cè)定以及移植物周邊的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果令人振奮，支架種植到正常肝臟4d后，支架周邊有更多的肝細(xì)胞增殖，7d后更多的肝臟組織滲透進(jìn)入支架中；部分肝切除術(shù)后2d，種植支架的肝臟較單純部分肝切除的肝臟有更多的肝細(xì)胞增殖。

四、前景與展望

將干細(xì)胞或者成熟的肝細(xì)胞種植到去細(xì)胞支架上，并在生物反應(yīng)器中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，是肝臟組織工程的基本思路。人或動(dòng)物來(lái)源的全器官脫細(xì)胞支架因保留有完整的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于血管系統(tǒng)的再生及營(yíng)養(yǎng)和氧氣的運(yùn)輸，較人工合成支架有較大的優(yōu)勢(shì)。人源性種子細(xì)胞在理論上可以將免疫排斥反應(yīng)降到最低。再生的器官移植到體內(nèi)之前，必須明確細(xì)胞在支架上所能發(fā)揮的功能及生物相容性。此外，細(xì)胞與周?chē)h(huán)境間的作用機(jī)制、肝臟ECM對(duì)細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用、相關(guān)生長(zhǎng)因子所起的作用等，都將是去細(xì)胞組織工程肝臟未來(lái)研究的方向.

作者：鄔迪單位：，南通大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科