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本文作者：蘇嵐1，曾令兵1,2周勇2張輝2高正勇2張金鳳2作者單位：1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料與試劑

草魚呼腸孤病毒GCRV-104株，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存;草魚腎臟組織細(xì)胞系，由本實(shí)驗(yàn)室建立與保藏［12］;大腸桿菌菌株DH5α、克隆載體pCR1、酵母表達(dá)載體pPICZB、畢赤酵母KM71菌株均購于Invitrogen公司。各種限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶購自Promega公司;TaqDNA聚合酶、10×PCRBuffer、dNTPs、DNAmarker為TaKaRa公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒及酵母DNA提取試劑盒為OMEGABio-Tek公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和ZeocinTM購自Invitrogen公司;蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司;一抗:鼠抗草魚呼腸孤病毒104株VP6蛋白多抗由本實(shí)驗(yàn)室制備;二抗:羊抗鼠IgG-HRP為ABCLONAL公司產(chǎn)品。

2VP6基因的PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank公布的GCRV-104株VP6基因編碼序列(HM234682)和酵母表達(dá)載體pPICZB所含的酶切位點(diǎn)，應(yīng)用軟件Premier5設(shè)計(jì)一對(duì)特異擴(kuò)增引物:P1:5''''-CggAATTCATggCACgTgTggTT-TAT-3'''';P2:5''''-TCCCCgCgggTgTggTTACgCgggTCAg-3''''，分別引入EcoRⅠ、SacⅡ酶切位點(diǎn)。CIK細(xì)胞培養(yǎng)和GCRV增殖按參考文獻(xiàn)進(jìn)行［13］。按TrizolReagent說明書提取病毒總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增VP6基因。PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5min;94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min30s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，克隆到pCR1載體，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒命名為pCR1-VP6，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α篩選鑒定后，含陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌命名為pCR1-VP6/DH5α。

3酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒從大腸桿菌pCR1-VP6/DH5α中提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體pPICZB分別用EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切，回收的VP6基因片段與載體片段在T4DNA連接酶的作用下過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在25μg/mLZeocin的抗性平板上篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒，以酵母特異AOXⅠ引物:FP:5''''-GACTG-GTTCCAATTGACAAGC-3'''';RP:5''''-GCAAATGGC-ATTCTGACATCC-3''''，進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒命名為pPICZB-VP6，含陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌命名為pPICZB-VP6/DH5α。

4電轉(zhuǎn)酵母菌及轉(zhuǎn)化子的篩選

重組質(zhì)粒pPICZB-VP6經(jīng)SacⅠ線性化，同時(shí)酶切空載體pPICZB做對(duì)照，異丙醇沉淀回收。酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化法參考EasySelectPichiaexpressionkitusermanual，Invitrogen。經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化入酵母KM71，電擊后的菌液涂布在Zeocin濃度分別為0.5、1.0、0、3.0、4.0、5.0mg/mL的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)2～4d。挑取在高濃度Zeocin平板上生長(zhǎng)良好的轉(zhuǎn)化子采用PCR方法篩選陽性轉(zhuǎn)化子，反應(yīng)條件同1.2，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行1.0%的瓊脂糖電泳分析。

5重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物鑒定

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種到25mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)至OD600值至6左右，離心收菌，重懸于5mLBMMY培養(yǎng)基，封瓶膜封口。30℃、250r/min的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，每24h補(bǔ)加100%的甲醇至終濃度0.5%(V/V)，設(shè)置電轉(zhuǎn)空載體的pPICZB/KM71菌株作為對(duì)照。誘導(dǎo)72h后，取菌液1mL，離心收集菌體用滅菌雙蒸水洗滌2次，加入蝸牛酶等滲溶液100μL(48mg蝸牛酶溶解于100μL5.48%的山梨醇溶液)，同時(shí)加入10μLβ巰基乙醇，37℃孵育1h，使酵母細(xì)胞壁破裂。離心后取裂解液上清、沉淀懸浮液(50μLPBS懸浮)以及對(duì)照裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。同時(shí)以常規(guī)方法進(jìn)行Western-blotting反應(yīng)［14］，一抗?jié)舛葹?∶2000，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗?jié)舛葹?∶20000，化學(xué)發(fā)光底物顯色。

結(jié)果與分析

1VP6基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取的GCRV104病毒總RNA為模板，用合成的特異擴(kuò)增引物P1、P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見一條大小約1300bp的特異性條帶，與預(yù)期大小(VP61319bp)一致，如圖1。對(duì)pCR1-VP6重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切，并送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GeneBank(HM234682)上的參考序列一致，表明成功克隆了GCRVVP6編碼基因。

2pPICZB-VP6重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將擴(kuò)增的GCRVVP6編碼基因克隆到酵母表達(dá)載體，構(gòu)建了重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZB-VP6，經(jīng)SacⅡ單酶切后得到大小約為4600bp的片段;經(jīng)EcoRⅠ、SacⅡ雙酶切后得到大小分別為1300bp和3300bp的片段，與預(yù)期酶解片段大小一致;以酵母AOXⅠ引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小約1600bp的片段(pPICZB載體上、下游引物之間序列長(zhǎng)度與目的片段長(zhǎng)度之和)，如圖2。測(cè)序結(jié)果與GeneBank公布的GCRVVP6基因參考序列一致，說明目的基因已正確克隆到酵母表達(dá)載體中。

3轉(zhuǎn)化酵母菌及轉(zhuǎn)化子的鑒定

重組酵母質(zhì)粒pPICZB-VP6經(jīng)SacⅠ線性化(圖3)后轉(zhuǎn)化到酵母KM71菌株，在Zeocin平板上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，以酵母AOXⅠ引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增出一條大小約1.6kb的特異條帶，與重組質(zhì)粒擴(kuò)增的結(jié)果一致，而空質(zhì)粒只擴(kuò)增出一條300bp的條帶(圖3)，表明VP6基因已整合到畢赤酵母基因組中。測(cè)序結(jié)果如圖4，表明重組到酵母基因組的VP6基因序列正確，并且酵母表達(dá)載體上的多聚組氨酸(6×His)標(biāo)簽和VP6在一個(gè)閱讀框內(nèi)，終止密碼子TGA位于His標(biāo)簽后。

4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western-Blotting檢測(cè)

對(duì)經(jīng)甲醇連續(xù)誘導(dǎo)72h的酵母培養(yǎng)物經(jīng)離心和破壁處理，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后重組菌株的裂解上清在46000處有一特異蛋白條帶，與GCRV天然VP6蛋白的分子量相符(圖5A);對(duì)照菌株中則無該條帶;誘導(dǎo)后重組菌株的沉淀懸浮液顯示弱的蛋白條帶。Western-Blot檢測(cè)結(jié)果如圖5B，重組酵母菌株表達(dá)的GCRVVP6蛋白可與鼠抗草魚呼腸孤病毒VP6的多抗特異性結(jié)合，在46000處出現(xiàn)單一雜交條帶;而裂解后的細(xì)胞沉淀、對(duì)照菌株則無雜交條帶，確證了表達(dá)產(chǎn)物是GCRVVP6蛋白。

討論

當(dāng)GCRVVP6蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中高效表達(dá)時(shí)，通常以不溶的包涵體形式存在，后期的溶解、復(fù)性過程耗時(shí)費(fèi)力，且復(fù)性率低;而利用桿狀病毒、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)操作復(fù)雜、表達(dá)水平低、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)昂貴。所以本實(shí)驗(yàn)研究了VP6蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)情況。另一方面，酵母獨(dú)特的細(xì)胞壁和微體(microbody)結(jié)構(gòu)，可以為在其中表達(dá)的外源蛋白提供一種生物微囊，使其免受消化道蛋白酶的降解［15］。本實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)表達(dá)條件為30℃、0.5%的甲醇添加量、72h，是根據(jù)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)在畢赤酵母中的表達(dá)情況初步確定的。本實(shí)驗(yàn)室曾將EGFP基因整合到酵母表達(dá)載體pPICZB多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoRⅠ和SacⅡ酶切位點(diǎn)間，并成功實(shí)現(xiàn)了其在酵母宿主菌KM71中的表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀分析表明在30℃、0.5%甲醇添加量的條件下，誘導(dǎo)24h時(shí)重組菌株開始表達(dá)，誘導(dǎo)72h時(shí)重組酵母的表達(dá)量最高，為提高VP6蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)水平可以進(jìn)一步對(duì)溫度、pH、OD值、甲醇添加量等條件進(jìn)行優(yōu)化。Batra等［16］成功在酵母胞內(nèi)載體pPICZA中表達(dá)了登革病毒2型包膜蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDVⅢ)，其蛋白表達(dá)量可達(dá)到50mg/L，并將此重組酵母添加到飼料中通過口服途徑免疫小鼠，結(jié)果誘導(dǎo)產(chǎn)生了高效價(jià)的中和抗體。Jha等［17］將WSSV的包膜蛋白VP19和VP28在畢赤酵母中表達(dá)后以口服的形式免疫小龍蝦，免疫組獲得了大于60%的免疫保護(hù)率。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)，將GCRVVP6抗原蛋白基因整合到高效表達(dá)的畢赤酵母中，成功實(shí)現(xiàn)了VP6蛋白在酵母菌中的表達(dá)，但重組酵母工程菌的表達(dá)量及其對(duì)魚體的免疫效果，還有待于下一步的魚體實(shí)驗(yàn)。采用疫苗免疫的方法是預(yù)防草魚出血病最為有效的途徑之一［18］。目前用于防治草魚出血病疫苗多采用浸泡和注射途徑給予，不僅操作繁瑣，而且引起魚體應(yīng)激反應(yīng)?？诜且环N最自然的免疫途徑，給藥安全、方便，使用不受時(shí)間、地點(diǎn)和魚體大小限制，對(duì)水生動(dòng)物不引起應(yīng)激反應(yīng)［19］。近年來，隨著對(duì)魚類黏膜免疫系統(tǒng)，尤其是口服免疫應(yīng)答機(jī)理的認(rèn)識(shí)不斷增加，為口服疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。開展酵母載體表達(dá)草魚呼腸孤病毒抗原蛋白技術(shù)的研究，可為草魚出血病口服疫苗的制備提供新的思路。