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本文作者：陸勝民1尹穎12陳劍兵1夏其樂1張俊1作者單位：1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所2.浙江師范大學化學與生命科學學院

商品化的柑橘果膠(CP)是從萊姆、檸檬、葡萄柚、甜橙等柑橘果皮中所提取的一種復雜多聚糖的長鏈碳水化合物，分子質(zhì)量一般在100ku以上。在食品工業(yè)中，柑橘果膠主要作為食品膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和乳化劑，用來制造果醬、果凍、果膠軟糖、果脯、蜜餞、乳制品、罐頭、果汁飲料等。研究表明，果膠具有降低血糖、血脂等作用，因此可用于生產(chǎn)防治糖尿病、肥胖癥、高血脂等疾病的保健食品[1]。

CP作為一種水溶性膳食纖維，具有抗癌活性[2]，但由于其分子質(zhì)量較大，食用后不易被腸道吸收，在人體內(nèi)很難發(fā)揮抗癌功效。CP經(jīng)過酸、堿、酶、高溫等處理可使得其長鏈斷裂，得到分子質(zhì)量較低的低分子柑橘果膠(LMCP)。LMCP因其分子質(zhì)量和酯化度較低，無分支，易被腸道吸收，并可進入血液循環(huán)進一步發(fā)揮抗癌作用[3]。

目前國際上還沒有統(tǒng)一的LMCP產(chǎn)品標準，主要通過pH修飾法對果膠多糖進行水解而制得。其中堿水解主要是引起皂化，降低果膠糖鏈的酯化度；酸水解主要是引起多糖鏈中糖苷鍵的斷裂，使原本的多糖長鏈降解為低分子質(zhì)量片斷[4-5]。不同濃度的酸、堿，不同的處理時間所得果膠在得率、分子質(zhì)量和酯化度上都會有所不同[6]。采用高溫處理CP制備LMCP的方法，具有操作簡單易行，且無任何毒副作用的優(yōu)點。本文以高溫處理法制備LMCP，并測定其分子質(zhì)量、半乳糖醛酸含量、酯化度和體外抗人前列腺癌激素不依賴型PC3細胞活性，以期為進一步開發(fā)LMCP抗癌輔助侯選藥物或功能性食品提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

柑橘果膠：浙江衢州果膠有限公司；半乳糖醛酸、葡聚糖分子質(zhì)量標準品、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他試劑均為分析純。Waters515型凝膠色譜儀：美國Waters公司，TOSOHBIOSEPG4000SWXL柱，Waters2410示差折光檢測器；UV-1800紫外分光光度計：島津公司；Model3111型CO2培養(yǎng)箱：ThermoFisher公司；Model680型酶標儀：BioRad公司。

1.2試驗方法

1.2.1LMCP的制備

稱取CP30g，置于5L三角瓶中，加少量95%酒精濕潤，然后加入3L沸水，攪拌溶解。待果膠溶解完全后，經(jīng)100目濾布過濾，濾液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原液的1/3。濃縮后的果膠液經(jīng)121℃高溫處理30min，自然冷卻后于-20℃冰箱中冷凍2~3h，再于-78℃冰箱中冷凍3h，最后進行冷凍干燥，樣品粉碎后即得到LMCP。

1.2.2半乳糖醛酸(GalA)含量的測定

采用間羥基聯(lián)苯法測定半乳糖醛酸含量[7]。取1.0mg/mL半乳糖醛酸標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，再分別取上述定容的溶液各1.0mL置于20mL具塞試管中，置于冰水浴中，加入四硼酸鈉-硫酸溶液5.0mL，用旋渦混合器混勻，于沸水浴中加熱5min，冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液100μL，混勻后振搖5min，超聲除去氣泡。以1mL蒸餾水同上操作制得空白液調(diào)零，在524nm波長處測定吸光度。以標準糖醛酸質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準工作曲線，分別稱取待測定樣品0.05g，置于50mL容量瓶中，定容，再分別量取0.5mL溶液，置于10mL容量瓶中定容，按標準曲線制作的方法進行樣品含量的測定，計算公式：（略）。

1.2.3酯化度(DE)測定

采用化學滴定法測果膠酯化度[8]。稱取5g果膠樣品到250mL錐形瓶中，加入5mL的濃鹽酸和100mL60%的乙醇，振搖10min。真空抽濾，每次用15mL的濃鹽酸和60%乙醇混合液(1:20，v/v)洗滌6次，再用60%的乙醇洗滌直至沒有明顯不溶物溶出為止。然后用20mL無水乙醇洗滌后，在60℃干燥2h，冷卻，稱重。稱取500mg干燥后的樣品到250mL錐形瓶中，加入2mL乙醇和100mL不含二氧化碳的沸水。蓋上蓋子振搖直至果膠完全溶解或已經(jīng)水解為止。加入5滴酚酞指示劑，用0.1mol/L的NaOH溶液標定，記錄標定體積V1。加入20mL0.5mol/L的NaOH溶液，塞緊，劇烈振搖15min。加入20mL0.5mol/L的HCl溶液，搖晃直至粉紅色消失，加入3滴酚酞指示劑，用0.5mol/L的NaOH溶液標定至淡粉紅色，記錄標定體積V2。酯化度為：E=V2/(V1+V2)。

1.2.4分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠色譜法測定分子質(zhì)量[9]，Waters515型凝膠色譜儀選用TOSOHBIOSEPG4000SWXL型色譜柱和Waters2410示差折光檢測器。流動相為0.2mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.5mL/min，柱溫40℃，進樣濃度為50μg/μL，進樣體積為50μL。

1.2.5抗前列腺癌細胞活性的測定

人前列腺癌PC3細胞購自中科院上海細胞庫，細胞活性抑制檢測方法為MTT法[10-12]。用含10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2并飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期PC3細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為4×104/mL，每孔100μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種24h后給藥(100μL/孔)，分別設(shè)空白對照組、細胞對照組以及5個濃度受試藥物組。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入100μLMTT(1mg/mL，以DMEM培養(yǎng)液溶解)，37℃培養(yǎng)4h，棄去各孔內(nèi)液體后加入150μL酸化異丙醇(含0.04mol/L鹽酸)，避光放置30min，酶標儀測定570nm處吸光度，計算受試藥物對PC3細胞的增殖抑制率，并以孫瑞元[13]教授編寫的NDST(NewDrugStatisticalTreatment)計算機程序計算受試物對腫瘤細胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，細胞生長抑制率公式如下：（略）。

2結(jié)果與分析

2.1LMCP特性分析

2.1.1半乳糖醛酸含量

果膠分子主鏈為帶負電荷的半乳糖醛酸鏈，半乳糖醛酸的含量影響果膠的電荷、酸堿性、成膠性及鈣離子結(jié)合等物理性質(zhì)。本實驗采用的是間羥基聯(lián)苯法測定半乳糖醛酸含量，此方法穩(wěn)定性好，標準曲線線性較好，而傳統(tǒng)的“硫酸-咔唑法”容易受到中性己糖和戊糖的干擾。半乳糖醛酸標準曲線見圖1。圖2顯示，天然CP的半乳糖醛酸含量的平均值為64%，經(jīng)過高溫處理后，LMCP半乳糖醛酸含量的平均值為78%，上升了21.88%。這可能是因為經(jīng)過高溫處理后，果膠酯化度降低，原本以酯化形式存在的半乳糖醛酸羧基變成了游離的羧基，使得半乳糖醛酸的含量上升。

2.2.2酯化度含量

酯化度決定著果膠的溶解度、凝膠能力和凝膠條件以及在特定pH下的穩(wěn)定性。從圖2可知，原料CP酯化度為59%，LMCP的酯化度為38%，下降35.6%。Jackson等[14]通過對商品名為PectaSol的市售改性柑橘果膠(MCP)的研究發(fā)現(xiàn)，PectaSol不具備前列腺癌細胞凋亡誘導作用，可能是經(jīng)過堿處理后同型半乳糖醛酸聚糖(HG)含量過高或酯化度過低所致。因此，低分子柑橘果膠酯化度并非越低越好，適度降低酯化度可增大溶解性，酯化度的降低也會改變果膠的一些理化性質(zhì)，但是LMCP作為抗癌藥物的備選物，其酯化度降低的利弊以及降低多少適宜還需要進一步的研究。

2.2.3分子質(zhì)量測定

以不同分子質(zhì)量的葡聚糖為標準品制作標準曲線，并在相同條件下分別對高溫處理前后的樣品進行分析，得到果膠熱處理前后的分子質(zhì)量分布如圖3、表1所示?？芍?，經(jīng)高溫處理后果膠分子質(zhì)量明顯降低，其Mn、Mw和Mp均低于10ku。

2.3藥理活性

未經(jīng)高溫處理的CP抗前列腺癌細胞活性見表2，經(jīng)過高溫處理后制得的LMCP抗前列腺癌細胞活性見表3。由表2可知未經(jīng)高溫處理的CP本身就具有一定的抑制癌細胞增殖的能力，且高劑量下(5~10mg/mL)抑制率達40%以上，對腫瘤細胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(6.68±0.05)mg/mL。從表3可知，經(jīng)過高溫處理后制得的LMCP對腫瘤細胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(3.55±0.44)mg/mL，相對于CP，其IC50降低了48.86%。雖然天然的CP具備一定的抑制癌細胞增殖的能力，然而，高劑量的CP不易被人體細胞吸收，實際進入體內(nèi)作用于癌細胞的可能性較小。比較表2和表3可知，中劑量(2.5mg/mL)下兩者抑制率很接近，但高劑量(5、10mg/mL)下LMCP對PC3的抑制率遠大于CP，且半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯低于CP，即表明經(jīng)過高溫處理后，抗前列腺癌細胞活性的能力顯著增強。試驗發(fā)現(xiàn)低劑量(0.625、1.25mg/mL)下LMCP對癌細胞增殖的抑制率為負值，由此推斷LMCP具有一定的營養(yǎng)作用，對正常細胞無毒害作用。相關(guān)研究報道表明低分子果膠抗癌主要是通過抑制癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成等多種活性[15]，并且具有一定的選擇性。張文博等[16]研究了MCP對肝癌U22細胞、宮頸癌U14細胞和肉瘤S180細胞的抗性，發(fā)現(xiàn)MCP對前兩種癌細胞有抗性，但對肉瘤S180細胞沒有抑制活性。

3結(jié)論

以天然柑橘果膠為原料，通過121℃處理30min可將果膠分子質(zhì)量降到10000u以下，半乳糖醛酸含量為78%，酯化度為38%的低分子柑橘果膠。細胞試驗表明制得的低分子柑橘果膠的對PC3細胞有很強的抑制作用，中劑量(2.5mg/mL)下抑制率可達38%，高劑量(5~10mg/mL)下抑制率達80%~90%，腫瘤細胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度為(3.55±0.44)mg/mL，相對于天然的柑橘果膠，其抗前列腺癌細胞活性顯著增強。