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本文作者：蘆鑫1,2孫強1,2宋國輝1,2張麗霞1,2李婧1黃紀(jì)念1,2作者單位：1.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工所2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心

花生是世界上廣泛種植的油料作物，2009年全球花生產(chǎn)量為34.40×106t。我國是花生的生產(chǎn)大國和消費大國，花生產(chǎn)量居世界第一，年均消費花生在12.56×106t[1]。目前，我國用于制油的花生占花生總消費量的一半以上，由此產(chǎn)生大量的花生餅粕。研究發(fā)現(xiàn)花生餅粕中含有多種營養(yǎng)成分，其中花生蛋白的含量超過40%?；ㄉ鞍缀腥梭w所需的8種必需氨基酸，消化性可達(dá)99%，是一種營養(yǎng)價值高、資源豐富的植物蛋白資源[2]。但當(dāng)前我國花生餅粕主要用于動物飼料，資源未得到充分利用，造成資源浪費。因此，國內(nèi)外開展從花生粕中提取加工花生蛋白的研究工作，其中將花生蛋白水解制備功能性花生肽是研究的熱點[3-5]。研究表明，以花生蛋白為原料制備的功能性肽具有明確的降血壓(ACE抑制)活性。但目前制備ACE抑制花生肽的工藝以直接加酶水解為主，這種制備方式造成酶活力的浪費，增加生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化推廣。由此，本文嘗試采用固定化酶技術(shù)將堿性蛋白酶2709固定后，以ACE抑制率與短肽生成率作為評價指標(biāo)，采用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化酶解條件，獲得最佳的酶解條件并分析酶解程度與ACE抑制活性之間的關(guān)系，為花生功能性肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

低溫花生餅粕：蛋白質(zhì)含量57.60%，水分含量6.53%，油脂含量5.63%，灰分4.90%，河南亮健科技有限公司；堿性蛋白酶2709：酶活225303μ/g，鄭州分子科貿(mào)有限公司；牛血清白蛋白、2,4,6-三硝基苯磺酸(TBNS)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippuryl-His-Leu，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、鄰苯二甲醛(o-Phthaldialdehyde，OPA)、考馬斯G250：美國Sigma公司；殼聚糖、磷酸二氫鈉、戊二醛、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

ZDDN-Ⅱ全自動凱氏定氮儀：浙江托普儀器有限公司；CaryEclipse熒光光度計：美國瓦里安公司；DGX-9243型鼓風(fēng)干燥箱：上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；LyovacGT1冷凍真空干燥機：德國SRK公司；DL-5-B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL-16A離心機：金壇市億通電子有限公司；XS205電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；ΜV-2802型紫外可見光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；DF-101S集熱兼磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；ZW-A微量振蕩器：常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器廠等。

1.3實驗方法

1.3.1花生蛋白的制備

取一定質(zhì)量的低溫花生餅粕，按照料液比1:10(w/v)加入pH為10.0的氫氧化鈉溶液，25℃下恒溫攪拌3h，隨后4000r/min離心20min，回收上清液并測定上清液的體積。將殘渣重新倒入燒杯中，加入與上清液相同體積的pH10.0的氫氧化鈉溶液，采用相同的攪拌和離心條件，合并1次和2次離心的上清液，采用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液到pH4.40，4℃靜置6h，4000r/min離心20min，水洗沉淀，冷凍干燥。

1.3.2堿性蛋白酶2709的殼聚糖固定

取一定量的殼聚糖，按料液比1:40(w/v)加入1%的醋酸溶液，室溫攪拌直至完全溶解。用注射器逐滴將殼聚糖溶液加入到3倍體積含有NaOH和乙酸乙酯混合溶液中(NaOH濃度為3%，乙酸乙酯濃度為1.25%)，室溫靜置3h，抽濾，蒸餾水沖洗3次。將殼聚糖微球加入到1.5%戊二醛溶液中，室溫攪拌3h，更換戊二醛溶液后，重新加入1.5%戊二醛溶液，4℃靜置過夜，抽濾，用蒸餾水和丙酮交替多次洗滌。將活化的殼聚糖微球加入到1%堿性蛋白酶溶液，室溫攪拌12h，隨后抽濾除去游離蛋白酶，4℃冰箱保存，其酶活力回收率為57.12%。

1.3.3固定化酶制備ACE抑制花生肽

將花生蛋白配成5%花生蛋白溶液后，在90℃加熱10min。取100mL熱處理后的花生蛋白溶液加入一定量的固定化堿性蛋白酶2709，在設(shè)定溫度下，恒溫攪拌若干時間后，取上清液測定短肽生成率、水解度和ACE抑制率，抽濾回收殼聚糖微球，酶解液4℃儲存。結(jié)合前期研究，發(fā)現(xiàn)加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間為影響酶解效果的關(guān)鍵因素。對以上因素的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，隨后采用SAS9.1.3軟件按Box-Behnken方法安排實驗條件，進(jìn)行實驗。

1.4測定方法

1.4.1蛋白水解度測定

取0.25mL上清液加入到試管中，隨后加入2mL，濃度0.1%(v/v)TNBS和2mL0.2mol/LpH8.20磷酸緩沖液，置于水浴鍋中50℃水浴振蕩60min，水浴過程中，采用鋁箔覆蓋遮光。隨后用4mL0.1mol/L的鹽酸進(jìn)行終止反應(yīng)，室溫靜置30min，以L-亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用340nm測定吸光度[6]。蛋白水解度計算公式如下：水解度(%)=h/htot×100(1)式中：h為水解物中1g被裂解肽鍵量，mmol/g；htot為1g原料蛋白質(zhì)總肽鍵量，mmol/g；花生蛋白的htot為7.49mmol/g[7]。

1.4.2短肽得率測定

參照趙世光等人的方法，并稍作修改[8]。取2.5mL酶解液，加入等體積10%(w/v)的三氯乙酸，混勻，4℃靜置30min，采用10000r/min離心20min。取離心后上清液和酶解液適當(dāng)稀釋，采用考馬斯亮藍(lán)G-250測定肽類質(zhì)量和蛋白總質(zhì)量，測定波長為595nm，以牛血清白蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。肽鏈得率(%)=(肽鏈質(zhì)量/上清液中蛋白總質(zhì)量)×100

1.4.3ACE抑制活性測定

將酶解液適當(dāng)稀釋，使用96孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器。將20μL樣液(無抑制的反應(yīng)液中以蒸餾水代替)與40μL底物溶液(底物是4.66mmol/LHHL的氯化鈉磷酸緩沖液)混合，然后加入40μL酶活濃度為12.5mU/mLACE酶液(對照液中以蒸餾水代替)，在微孔板混合器上混勻后置于37℃恒溫箱中反應(yīng)1h，然后加入1.2mol/LNaOH溶液150μL終止酶反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入2%OPA甲醇溶液40μL，混合均勻，室溫下靜置20min后加入6mol/L的HCl溶液40μL終止衍生反應(yīng)。將上述溶液稀釋50倍后，測定熒光吸收強度，測定的激發(fā)波長340nm；發(fā)射波長為455nm；狹縫寬度為5nm。樣液的ACE抑制活性的計算公式如下：ACE抑制率(%)=[1-(a-c)÷(b-d)]×100(2)式中：a為抑制劑與ACE都存在時的熒光吸收強度；b為抑制劑不存在而ACE存在時的熒光吸收強度；c為抑制劑存在而ACE不存在時的熒光吸收強度；d為抑制劑與ACE都不存在時的熒光吸收強度。ACE抑制率越大，表明該樣品的ACE抑制活性越強。

1.4.4其他測定方法

低溫花生餅粕成分測定方法如下：蛋白測定采用凱氏定氮法GB5009.5—2010，N為5.46；灰分測定采用550℃灰化法GB/T5505—2008；水分測定采用105℃恒重法GB5512—1985；粗脂肪測定采用索氏抽提法GB/T14772—2008。蛋白酶酶活標(biāo)定采用Folin法SB/T10317—1999，其酶活測定pH為10。

1.5數(shù)據(jù)處理

無特殊說明，實驗平行測定3次。采用SAS9.1.3和MicrosoftofficeExecl2007分析和處理數(shù)據(jù)。本文中，p<0.01為高度顯著，p<0.05為顯著。

2討論與分析

2.1酶解條件對短肽生成率的影響

采用SAS分析短肽生成率(見表2)發(fā)現(xiàn)，整個模型高度顯著(p=0.0001)，這表明響應(yīng)面模型真實反映客觀事實；失擬項不顯著(p=0.0538)，這說明沒有遺漏重要的影響因子，選取的酶解因素全面；R2=98.90，調(diào)整R2=97.62%，這說明響應(yīng)面模型和實際結(jié)果擬合程度好。分析影響因素發(fā)現(xiàn)，加酶量和酶解時間是高度顯著因素(p<0.01)，酶解pH是顯著因素(p=0.0171)，酶解溫度是非顯著因素(p=0.7779)。酶解溫度是非顯著因素的原因可能是固定化酶增強了堿性蛋白酶的耐熱穩(wěn)定性。獲得的擬合曲線如下(實際值)：（略）。由于酶解溫度是非顯著影響因素，下面只分析加酶量、酶解pH和酶解時間對短肽生成率的影響。由圖1(a)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10時，固定酶解時間為120min考察加酶量對短肽生成率的作用可以發(fā)現(xiàn)，加酶量從1200增加到1600μ/g蛋白時，可以顯著提高短肽生成率，但繼續(xù)增加加酶量到2000μ/g蛋白時，短肽生成率增加緩慢。這是由于增加加酶量增加酶分子與底物之間碰撞機率，從而加速酶水解的反應(yīng)速率，單位時間內(nèi)提高短肽生成率。但在反應(yīng)體系內(nèi)，底物的酶作用位點有限，底物充分水解后，反應(yīng)達(dá)到平衡，繼續(xù)加入蛋白酶不能提高短肽生成率。當(dāng)固定加酶量為1600μ/g蛋白時，酶解時間從60min延長120min，短肽生成率迅速上升，當(dāng)酶解時間從120min延長到180min時，短肽生成率增加緩慢。這是因為酶反應(yīng)剛開始時，體系中有豐富的底物可以被酶水解，此時增加反應(yīng)時間，短肽生成率增加，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系內(nèi)反應(yīng)底物與生成物達(dá)到動態(tài)平衡，延長反應(yīng)時間也不能有效提高短肽生成率。由圖1(b)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解時間為120min時，固定加酶量為1600μ/g蛋白時，當(dāng)酶解pH從9增加到10時，短肽生成率上升，繼續(xù)增加pH到11，短肽生成率有所下降。盡管固定化酶在一定程度上提高酶對溫度、pH的耐受性，但從結(jié)果來看，體系pH依然會影響固定化的堿性蛋白酶在反應(yīng)體系中的構(gòu)象，從而帶來酶催化活性差異，從而對短肽生成率產(chǎn)生影響。

2.2酶解條件對蛋白水解度的影響

蛋白水解度是衡量蛋白水解程度的重要指標(biāo)。響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)，模型高度顯著(p=0.0001)，失擬項不顯著(p=0.0515)，R2=0.9831，調(diào)整R2為0.9635，因此該模型真實反映水解度變化情況，可以進(jìn)行影響因素方差分析。分析影響因素發(fā)現(xiàn)，加酶量和酶解時間都是高度顯著影響因素(p=0.0001)，而酶解溫度和酶解pH是非顯著影響因素(p=0.3880和0.2218)。獲得的回歸方程如下(實際值)：（略）。由圖2(a)所示，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10，固定加酶量分析酶解時間的影響，酶解時間從60min增加到120min，蛋白的水解度迅速增加，當(dāng)酶解時間從120min延長到180min，蛋白水解度增加放緩。由于每種蛋白酶都有其特定酶水解位點，因此酶解反應(yīng)是有限水解，反應(yīng)達(dá)到平衡時，其水解度逐漸趨于穩(wěn)定，這也是酶解時間從120min延長到180min時，蛋白水解度變化不明顯的原因。當(dāng)固定酶解時間分析加酶量影響時，增加加酶量有利于蛋白水解，因此獲得酶解產(chǎn)物的水解度較高，但當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，酶解反應(yīng)速度加快，水解產(chǎn)物快速生成并在體系中濃度達(dá)到穩(wěn)定，因此水解度變化不明顯。

2.3酶解條件對ACE抑制活性的影響

研究表明：酶解法制備ACE抑制肽受多種因素的影響，如蛋白酶種類、蛋白底物種類、酶解條件、酶解程度等[9-10]。分析表2中的ACE抑制率結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型高度顯著(p=0.0001)，失擬項不顯著(p=0.0522)，R2=93.34%和調(diào)整R2=85.57%，因此模型真實客觀的反映酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性。方差分析發(fā)現(xiàn)：加酶量和酶解時間是高度顯著影響因素(p=0.0001)，而酶解溫度和酶解pH是非顯著影響因素(p=0.7055和0.7488)，獲得的回歸方程如下(實際值)：（略）。加酶量和酶解時間對ACE抑制率的影響見圖2(b)。由圖2(b)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10，固定加酶量分析酶解時間的影響發(fā)現(xiàn)，延長酶解時間有利于酶解液ACE抑制活性的提高，但超過140min后，ACE抑制活性有所下降。具有ACE抑制活性的多肽是蛋白酶解產(chǎn)物的一部分，延長酶解時間會使這部分多肽被降解，逐漸喪失ACE抑制活性，從而降低ACE抑制率。固定酶解時間分析加酶量影響發(fā)現(xiàn)，適量增加加酶量有利于ACE抑制肽的生成，過量的加酶量反而會使ACE抑制肽水解，導(dǎo)致ACE抑制率下降。

2.4短肽生成率、水解度和ACE抑制率的關(guān)系

工業(yè)化制備ACE抑制肽需要兼顧2個指標(biāo)：短肽生成率和ACE抑制率。由于蛋白酶解反應(yīng)復(fù)雜，會產(chǎn)生多種性質(zhì)不同的多肽產(chǎn)物。因此，需要通過水解度來衡量酶解產(chǎn)物組成和控制酶解反應(yīng)程度。在現(xiàn)有的實驗條件下，酶解條件中加酶量和酶解時間對短肽生成率、水解度和ACE抑制率具有高度顯著影響，因此以加酶量和酶解時間作為自變量，短肽生成率、水解度和ACE抑制率作為應(yīng)變量作圖，考察它們在酶解條件改變后，它們之間的相互關(guān)系。由圖4(a)可知，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白水解度和短肽生成率上升，且二者具有高度的正相關(guān)性，即低的水解度往往對應(yīng)著較低的短肽生成率，當(dāng)水解度大于18%時，短肽生成率在80%以上。由圖4(b)可知，伴隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性迅速增加，但從水解度和ACE抑制率曲線變化趨勢可知，過高的水解度并不對應(yīng)高的ACE抑制活性。這是可能是多肽的過分水解后，喪失了ACE抑制結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致ACE抑制活性下降。由圖4(c)可知，適當(dāng)增加加酶量和酶解時間會提高短肽生成率和ACE抑制率，但過度延長水解過程和增加加酶量，短肽產(chǎn)率增加有限而ACE抑制率下降。短肽生成率最大值對應(yīng)的酶解條件和ACE抑制率最大值的酶解條件不重合。通過SAS計算，獲得最大短肽生成率的酶解條件為：加酶量取1765.98μ/g蛋白，酶解時間為181.61min，酶解pH為10.07，酶解溫度為45.08℃，此時對應(yīng)的短肽生成率為84.95%±0.60%。獲得最大ACE抑制率的酶解條件為：加酶量為1766.73μ/g蛋白，酶解時間為142.26min，酶解pH為9.97，酶解溫度為45.25℃，此時對應(yīng)的短肽生成率為84.00%±2.87%。為了獲得高的ACE抑制活性和短肽產(chǎn)率，最佳的酶解條件確定為：加酶量1767μ/g蛋白，酶解時間143min，酶解pH為10.00，酶解溫度取45℃，獲得的短肽生成率和ACE抑制率為82.67%和83.48%。

3結(jié)論

采用殼聚糖固定堿性蛋白酶2709水解花生蛋白制備ACE抑制肽發(fā)現(xiàn)：加酶量酶解時間是影響短肽生成率、ACE抑制率和水解度的高度顯著因素。最佳的酶解工藝是：加酶量1767μ/g蛋白，酶解時間143min，酶解pH為10.00，酶解溫度取45℃，獲得的短肽生成率和ACE抑制率為82.67%和83.48%。分析短肽生成率、蛋白水解度和ACE抑制率的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)：適當(dāng)增加水解度可以提高酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，但過度水解會導(dǎo)致ACE抑制率下降。