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【摘要】目的測(cè)定廣東土牛膝中腺苷的含量。方法采用反相高效液相色譜法，色譜柱：DiamonsilTMC18柱，流動(dòng)相：甲醇磷酸鹽緩沖溶液（體積比12∶88），流速：1.0mL·min-1，檢測(cè)波長260nm，柱溫30℃。結(jié)果腺苷的平均回收率為99.5%，RSD值為1.69%;方法精密度試驗(yàn)RSD值為1.15%(n=6)。結(jié)論該法可用于廣東土牛膝中腺苷的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】廣東土牛膝；腺苷；hplc；含量測(cè)定

Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentofadenosineinRadixEupalorriChinenseLinnbyRPHPLC.MethodsSampleswereanalyzedonaDiamonsilTMC18column（250mm×4.6mm，5μm）usingCH3OHNaH2PO4·Na2HPO4(12∶88)asmobilephase.Theflowratewas1.0mL·min-1andthedetectionwavelength260nm.ResultsThemethodexhibitedgoodlinearityfrom0.0396to0.6336μg.Theaveragerecoveryforadenosinewas99.5%andRSD1.69%(n=6).ConclusionThemethodcouldbeusedtodetermineadenosinecontentinRadixEupalorriChinenseLinn.

Keywords:RadixEupalorrichinenseLinn;adenosine;RPHPLC

廣東土牛膝（RadixEupalorriChinenseLinn）為菊科植物華澤蘭的干燥根及根莖，廣東土牛膝資源豐富，分布較廣，在民間沿用歷史悠久，具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮(zhèn)痛的功效［1,2］，臨床上常用于治療各種咽喉炎、扁桃腺炎等。為評(píng)價(jià)廣東土牛膝的內(nèi)在質(zhì)量，本文以腺苷為指標(biāo)成分［3］，建立了廣東土牛膝中腺苷含量測(cè)定的高效液相色譜法，該法具有分離效果好，簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于該藥材的初步質(zhì)量控制。

1儀器和試藥

1.1儀器

日本島津高效液相色譜儀(LC10ATvp溶劑輸送泵，SPD10Avp紫外可見檢測(cè)器，CTO10Asp柱溫箱)，HW2000色譜工作站（南京千譜軟件公司）。

1.2藥材來源及處理

土牛膝樣品（批號(hào)20051102，東莞國藥集團(tuán)中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣東；批號(hào)20060109，東莞國藥集團(tuán)中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣東；批號(hào)0500201，佛山康泰和醫(yī)藥有限公司中藥飲片加工廠，產(chǎn)地廣東），由廣東藥學(xué)院生藥學(xué)教研室劉基柱副教授鑒定為菊科澤蘭屬植物華澤蘭(EupalorrichinenseLinn)的根及根莖。將其粉碎，于60℃下干燥4h，置干燥器內(nèi)備用。

1.3藥品與試劑

腺苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)879-200202，供含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為分析純。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液

取本品粉末（過3號(hào)篩）約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇20mL，稱定重量，超聲處理45min，放冷，再稱定重量，用50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.2對(duì)照品溶液

精密稱取腺苷對(duì)照品9.90mg，置50mL量瓶中，加50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇適量，振搖使溶解，再加50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為198μg·mL-1的腺苷對(duì)照品貯備液。

2.2色譜條件及系統(tǒng)用性試驗(yàn)

色譜柱：DiamonsilTM(鉆石)C18柱（250mm×4.6mm，5μm，迪馬公司）；流動(dòng)相：甲醇磷酸鹽緩沖溶液［取0.01mol·L-1磷酸二氫鈉68.5mL與0.01mol·L-1磷酸氫二納31.5mL混合（pH＝6.5）］（體積比12∶88）；流速：1.0mL·min-1，檢測(cè)波長：260nm；柱溫：30℃。分別取對(duì)照品溶液（腺苷濃度為7.92μg·mL-1），供試品溶液20μL注入色譜儀，按上述色譜條件，記錄色譜圖（圖1,2）。腺苷和樣品中相鄰色譜峰的分離度大于1.5；理論塔板數(shù)以腺苷峰計(jì)算不低于3000；保留時(shí)間約為17.40min。

圖1腺苷對(duì)照品HPLC圖略

圖2廣東土牛膝藥材樣品HPLC圖略

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性與范圍

分別精密吸取一定量的對(duì)照品貯備液用50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇稀釋成濃度為1.98、3.96、7.92、15.84、23.76、31.68μg·mL-1的對(duì)照品溶液，分別取20μL進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品質(zhì)量濃度（ρ）進(jìn)行回歸，得回歸方程A=32416.91ρ+1071.34，r=0.9999，試驗(yàn)表明腺苷在0.0396～0.6336μg之間與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為7.92μg·mL-1的腺苷對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并計(jì)算，結(jié)果腺苷峰面積的平均值為256682，RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取土牛膝供試品溶液（批號(hào)20051102），在0、2、4、8、12h分別進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，結(jié)果腺苷峰面積的平均值為229720，RSD為1.69%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)20051102）樣品6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果腺苷平均含量為0.1406mg·g-1，RSD為1.15%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量（批號(hào)20051102）土牛膝樣品約0.5g，共9份，分別用刻度吸量管精密加入濃度為198μg·mL-1的腺苷對(duì)照品溶液0.23、0.23、0.23、0.36、0.36、0.36、0.50、0.50、0.50mL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣20μL進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1腺苷回收率試驗(yàn)結(jié)果略

2.4樣品測(cè)定

取土牛膝樣品3批，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別取7.92μg·mL-1的對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算腺苷的含量，結(jié)果見表2。

表2樣品的測(cè)定結(jié)果（略）

3討論

3.1提取溶劑的選擇分別用不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、90%）甲醇混合液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果腺苷的含量分別為0.1398、0.1408、0.1383、0.1267μg·mL-1，表明用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶劑提取比較完全。

3.2腺苷提取方法選擇文獻(xiàn)［4-7］主要用超聲處理和加熱回流方法,本文考察了以50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇為提取溶劑，樣品分別超聲處理和回流處理，結(jié)果腺苷的含量分別為0.1408、0.1385μg·mL-1,并且超聲處理45min與60min的結(jié)果一致，因此選擇45min作為提取時(shí)間。

3.3檢測(cè)波長的選擇取腺苷對(duì)照品溶液，用50%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液做參比，置紫外可見分光光度計(jì)儀器中，在210～400nm波長掃描，結(jié)果腺苷對(duì)照品溶液在260nm處有最大吸收波長,故選擇260nm作為檢測(cè)波長。

3.4流動(dòng)相的選擇曾參考《中國藥典》2005年版一部“冬蟲夏草”的腺苷含量測(cè)定方法［5］，以甲醇pH＝6.5磷酸鹽緩沖溶液（體積比17∶3）作為流動(dòng)相條件，但在試驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)在這種流動(dòng)相條件下腺苷與其他組分的峰的分離狀況并不好，經(jīng)過對(duì)柱溫和不同比例的甲醇磷酸鹽緩沖溶液流動(dòng)相的試驗(yàn)，結(jié)果以甲醇pH＝6.5磷酸鹽緩沖溶液（體積比12∶88），柱溫30℃時(shí)，土牛膝中腺苷可和其他組分基線分離，并且峰形良好，該法分離效果好，準(zhǔn)確，可用于廣東土牛膝藥材的初步質(zhì)量控制。

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