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【摘要】目的基于宮頸癌比較基因組雜交資料構(gòu)建宮頸癌的樹模型，探討宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的多途徑模式。方法根據(jù)收集的58例宮頸癌完整比較基因組雜交資料，利用Desper等建立的腫瘤樹模型軟件平臺，構(gòu)建宮頸癌的樹模型。結(jié)果宮頸癌樹模型提示，有6個非隨機(jī)的染色體擴(kuò)增或者缺失事件發(fā)生在宮頸癌變過程中：+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p，其中+3q和+1q可能是宮頸癌癌變中的重要早期事件；+3q要先于+17q發(fā)生，并且兩者之間可能存在先后依存關(guān)系；而且，+1q可能是一個相對獨立發(fā)生的事件；這些擴(kuò)增染色體上可能存在與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展演進(jìn)密切相關(guān)的瘤基因。結(jié)論基于比較基因組雜交資料構(gòu)建的宮頸癌樹模型，提示宮頸癌多階段、多途徑的發(fā)展演進(jìn)模式，也為后續(xù)宮頸癌相關(guān)基因的探索指明了方向。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌;比較基因組雜交;樹模型

Abstract:ObjectiveBasedonCGH(comparativegenomichybridization,CGH)data,toconstructtreemodelofcervicalcarcinomaandtoexploremultipathwaymodelofcervicalcarcinomaprogression.MethodsUsingthesoftwarewhichDesperetaldeveloped,treemodelsofcervicalcarcinomawereconstructedaccordingtotheCGHdataof58cervicalcarcinomapatients.ResultsTreemodelsforcervicalcarcinomasuggestedthattherewere+1q，+3q，+5p，+17q，+20qand+20psixnonrandomgeneticevents,and+1qand+3qmightbeimportantearlyeventsincervicalcarcinogenesis,indicatingthattheremightbecancerrelatedgenesinthesechromosomalarms.Aschangesof+3qoccurredpriortothoseof+17q,theremightbesomecauseeffectrelationship.Thechangesof+1qmightbeaindependentgeneticevent.ConclusionTreemodelsbasedonCGHdataofcervicalcarcinomaimplyits’multistepandmultipathwayprogressionanddirecthowtosearchingforcervicalcancerrelatedgenes.

Keywords:cervicalcarcinoma;comparativegenomichybridization;treemodel

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是基因改變不斷發(fā)生、不斷累積的結(jié)果。那么，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，基因改變的模式如何呢？1988年，Vogelstein等［1］首次提出了結(jié)直腸癌演進(jìn)的經(jīng)典模型，即結(jié)直腸癌的演進(jìn)由4個遺傳事件以鏈?zhǔn)侥Ｊ桨l(fā)展的，即路徑模型：染色體5q上APC基因的缺失或突變；12p上Kras基因的突變；18q上DCC基因的缺失；17p上p53基因的缺失或突變。第一個事件的發(fā)生能增加第二個事件發(fā)生的概率，第二個事件的發(fā)生能增加第三個事件發(fā)生的概率，依次類推。這些基因改變一旦發(fā)生，就是一個不可逆的發(fā)展演進(jìn)過程。腫瘤演進(jìn)的經(jīng)典路徑模型對于確定腫瘤早期診斷或治療的相關(guān)基因位點具有重要價值。于是，人們試圖在其他腫瘤的演進(jìn)過程中找到與結(jié)直腸癌類似的路徑模型，但是，都沒有成功［2］。事實上，在腫瘤的發(fā)展演進(jìn)過程中，遺傳物質(zhì)的改變不會總是按照一定的順序、沿著一條路徑發(fā)生，而且，即使在臨床上或者病理學(xué)上認(rèn)為同質(zhì)的腫瘤，其本身存在異質(zhì)性［3］。因此，探索不依賴于單純線性演進(jìn)的腫瘤發(fā)展模型是很有必要的。Desper等［4,5］提出了反應(yīng)腫瘤異質(zhì)性的腫瘤發(fā)生發(fā)展的兩種進(jìn)化樹模型，即分枝樹和距離樹。為此，本研究利用Desper等基于比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH）資料建立的樹模型軟件并加以改進(jìn)，對58例宮頸癌患者（其中包括4種宮頸癌細(xì)胞株）的CGH資料進(jìn)行了分析，構(gòu)建了宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的樹模型。

1材料與方法

1.1材料

收集了58例宮頸癌完整CGH檢測資料，其中FIGO分期Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例，還有4種宮頸癌細(xì)胞株的CGH資料［6-9］。

1.2事件的選擇

CGH檢測的結(jié)果是一個關(guān)于染色體拷貝數(shù)量改變（copynumberaberrations,CNAs）的遺傳事件集。本文利用最常用的Brodeur法［10］選擇一組非隨機(jī)事件，Brodeur法假設(shè)擴(kuò)增和丟失的機(jī)會均等，并與染色體臂長成正比［11］。構(gòu)建樹模型的數(shù)據(jù)是一系列的染色體擴(kuò)增和丟失，一例病人對應(yīng)一行數(shù)據(jù)，記錄的是染色體臂水平擴(kuò)增和丟失。人類有22對常染色體和X、Y兩條性染色體，所有染色體都有長臂q，而13、14、15、21、22號染色體短臂p很短，本文排除了這5個染色體短臂，還忽略了1p、16p、19p、19q和22q這5個染色體臂，因為這些區(qū)域富含胞嘧啶和鳥嘌呤，易出現(xiàn)假陽性；另外，還忽略了Y染色體，因為其短且很少改變。這樣就剩下36條染色體臂需要分析，而每條染色體臂都有可能擴(kuò)增或丟失，因此，總共有72個可能事件。

1.3樹模型

1.3.1分枝樹（branchingtrees）

Desper等人［4］利用基于計算機(jī)技術(shù)的最大權(quán)重分枝方法提出的一種重構(gòu)腫瘤發(fā)生發(fā)展的樹模型方法，并稱這種樹模型為分枝樹。該模型把一個節(jié)點作為根（root），而其他的每個節(jié)點都代表一個遺傳事件。在一個樹枝上，i>j表示一種假說的因果關(guān)系，即事件i的出現(xiàn)使得事件j的發(fā)生更為可能。分枝樹實際上是Vogelstein路徑模型的泛化，也就是將腫瘤發(fā)生的一條路徑模型轉(zhuǎn)化為多條路徑模型（multiplepathways），一個樹干即為一條路徑，更直觀地體現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性。分枝樹提示：（1）靠近樹根的事件可能是早期事件，也可能是因為與其他事件的發(fā)生相關(guān)性不大而置于近根部；（2）在一個樹枝（edge）上按順序走向的事件有可能存在因果關(guān)系；（3）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤亞型（subclass）的標(biāo)志。

1.3.2距離樹（distancebasedtrees）

Desper等人［5］利用現(xiàn)有的系統(tǒng)發(fā)育算法建立另一種樹模型。該模型把所有的事件都作為葉子，同時把隱含的、未命名的事件作為內(nèi)在節(jié)點。該模型的另一個不同點是，樹中的每一個樹枝都有長度，因此，基于這種方法建立的樹模型被稱作距離樹。從根到其他事件i的距離為log(pi),其中pi是事件i的觀察概率，可見，事件i的觀察概率越大，它離樹根的距離越近，即越早發(fā)生。距離樹提示：（1）靠近根的事件是早期事件；（2）集聚在樹的分枝（subtree）下的事件可以作為腫瘤的亞型（subclass）標(biāo)志。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS10.0forwindows統(tǒng)計軟件包進(jìn)行χ2檢驗,當(dāng)n<40或頻數(shù)<1時,用確切概率法。

2結(jié)果

2.1宮頸癌發(fā)展演進(jìn)樹模型的構(gòu)建

宮頸癌樹模型見圖1。從分枝樹模型可以看出，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，+1q是相對較獨立的事件，+3q的出現(xiàn)可能導(dǎo)致+17q的發(fā)生，而+17q的發(fā)生又將促進(jìn)+20q的發(fā)生，+20q的發(fā)生必將增加+5p、+20p出現(xiàn)的概率。從距離樹可以清楚地得出+3q是宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中較重要的早期事件。

2.2宮頸癌中非隨機(jī)染色體事件的統(tǒng)計分析

58例宮頸癌（其中4個細(xì)胞株）樣本中，+1q，+3q，+5p，+17q，+20q和+20p分布見表2，各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。表1宮頸癌6個非隨機(jī)染色體事件分布情況（略）

2.3根據(jù)宮頸癌樹模型可以看出，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標(biāo)記，一種以+1q為標(biāo)記；宮頸癌染色體改變以擴(kuò)增為主。

3討論

自從1988年Vogelstein等［1］提出結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的經(jīng)典路徑模型，科學(xué)研究者們希望其他腫瘤的發(fā)展演進(jìn)也有與結(jié)直腸癌相似的經(jīng)典路徑模式，但是都沒有取得理想的結(jié)果。原因是腫瘤是一個多因素參與、多基因改變、多步驟發(fā)展的復(fù)雜過程，腫瘤具有異質(zhì)性。

比較基因組雜交技術(shù)可以在染色體或染色體亞區(qū)水平上對DNA序列拷貝數(shù)進(jìn)行檢測、定位。它最大的優(yōu)點是一次雜交就可以全面檢測出腫瘤基因組復(fù)雜的遺傳改變，包括染色體區(qū)段拷貝數(shù)的增加或減少。為了深入挖掘從大量標(biāo)本獲得的海量CGH資料中蘊(yùn)含的關(guān)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的規(guī)律，Desper等根據(jù)數(shù)學(xué)原理結(jié)合計算機(jī)技術(shù)開發(fā)出了一種CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件，即根據(jù)CGH資料數(shù)據(jù)構(gòu)建腫瘤發(fā)生、發(fā)展、演進(jìn)的2種樹模型：分枝樹和距離數(shù)。他們利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了116例腎透明細(xì)胞癌的CGH資料，并構(gòu)建了腎透明細(xì)胞癌的2種樹模型，結(jié)果分析與以前細(xì)胞遺傳學(xué)研究的結(jié)果相吻合，如3p丟失是腎透明細(xì)胞癌發(fā)生的早期事件，根據(jù)樹模型還提出了腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中有意義的新假說［12］。這有力地說明構(gòu)建基于CGH資料的腫瘤樹模型對于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展及其演進(jìn)規(guī)律是非常有意義的。

尹志華［13］等利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了收集到的127例結(jié)直腸癌的CGH資料，構(gòu)建了結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的樹模型，結(jié)果顯示，樹模型與Vogelstein的經(jīng)典路徑模型有一定的吻合度，如-18q先于-17p發(fā)生，而且使后者的發(fā)生可能性更大。兩者差別也是明顯的，與經(jīng)典路徑模型相比，樹模型更體現(xiàn)了腫瘤的異質(zhì)性及腫瘤發(fā)生發(fā)展的多途徑模式，更符合現(xiàn)代關(guān)于腫瘤發(fā)生發(fā)展演進(jìn)的理論，經(jīng)典路徑模型顯得過于簡單。

本研究利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件分析了58例宮頸癌CGH資料，構(gòu)建了宮頸癌發(fā)生發(fā)展的樹模型，模型各染色體臂改變的頻率如下：+1q為36.2%；+3q為70.7%；+5p為20.0%；+17q為24.1%；+20q為15.5%；+20p為15.5%。Lazo等［14］研究發(fā)現(xiàn)，90%的浸潤宮頸癌中發(fā)現(xiàn)有3q的擴(kuò)增。Wilting等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌中常見20q拷貝數(shù)的擴(kuò)增。樹模型提示，+1q和+3q可能是宮頸癌癌變較早期事件，統(tǒng)計分析結(jié)果也證明了這一點，+1q、+3q和+17q在宮頸癌的發(fā)展演進(jìn)過程的各個階段中差異沒有顯著性（P＞0.05）。

Andersson等［16］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌中，3q26上人端粒酶基因TERC常見擴(kuò)增，并可作為宮頸腺癌的診斷指標(biāo)。+5p和+20p在宮頸癌早期和進(jìn)展期中，差異有顯著性（P＜0.05），進(jìn)展期高于早期，說明+5p和+20p是宮頸癌發(fā)展演進(jìn)的晚期事件，+20q在宮頸癌發(fā)展演進(jìn)中的確切作用有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步確定。根據(jù)樹模型可以推測，宮頸癌可能存在2種亞型：一種以+3q、+5p、+17q、+20p和+20q為標(biāo)記，一種以+1q為標(biāo)記；宮頸癌染色體改變以擴(kuò)增為主。

總之，利用CGH資料數(shù)據(jù)分析軟件構(gòu)建基于CGH資料的腫瘤發(fā)生發(fā)展的樹模型，對于挖掘蘊(yùn)含在海量數(shù)據(jù)中的腫瘤發(fā)生發(fā)展演進(jìn)規(guī)律具有重要意義。本研究提示+1q、+3q、+5p、+17q、+20p和+20q是宮頸癌發(fā)生發(fā)展演進(jìn)過程中的非隨機(jī)事件，提示在這些染色體臂上可能存在與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤基因，為后續(xù)相關(guān)研究指明了方向。

由于CGH技術(shù)存在敏感性低的缺點，小于10Mb的染色體改變檢測不出［17］，一些染色體缺失11q23，2p,3p,18q21.3和11p15.5等未出現(xiàn)在樹模型中［18，19］。但是,一次實驗就能給出了一個腫瘤全基因組水平的遺傳改變的全貌?；贑GH資料和數(shù)學(xué)模擬建立的腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)化樹模型，科學(xué)地闡明了腫瘤發(fā)生發(fā)展的多基因、多步驟的演進(jìn)過程，體現(xiàn)了腫瘤內(nèi)在的異質(zhì)性。深入分析宮頸癌進(jìn)化樹模型中的6個非隨機(jī)染色體事件，對于發(fā)現(xiàn)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因，闡明宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制等具有重要指導(dǎo)意義。

致謝：衷心感謝美國國立健康研究所（NIH）的DesperR和SchafferA為本分析CGH資料所提供的熱情幫助。

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