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【摘要】在文獻檢索的基礎上，對近10年來在中藥作用機理中主要應用的分子生物學技術——核酸分子雜交技術、反轉錄-聚合酶鏈式反應技術、差異顯示PCR技術和DNA陣列技術的基本原理、應用實例、優(yōu)勢與不足做了概述，并對未來的中藥機理研究技術、方向和前景做了展望。

【關鍵詞】分子生物學技術；中藥；作用機理

中藥自古以來就是我國人民防治疾病的主要武器，對中華民族的生存與繁衍起著不可忽視的作用，長期的醫(yī)療實踐累積了寶貴而豐富的經(jīng)驗，并與中醫(yī)學共同形成了一套完整獨特的理論體系。但如何用現(xiàn)代科學技術語言闡釋其作用機理，提供科學依據(jù)，使其廣為世界接受是一重大難題。近年來，分子生物學技術的發(fā)展，不僅根本性地改變了生命科學的研究方式，也為中藥的作用機理研究提供了有力工具和良好的發(fā)展契機，使得中藥基因轉錄水平的機理研究成為可能。筆者對近10年來有關分子生物學技術在中藥基因轉錄水平作用機理研究中的應用綜述如下。

1核酸分子雜交技術

核酸分子雜交技術是分子生物學的基本技術之一，基本原理是具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下按堿基互補原則退火形成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針。其中將核酸提取分離后在體外與探針雜交的是印跡雜交，直接在組織細胞內(nèi)進行的是原位雜交。

中藥作用機理研究中較早常用的有RNA印跡雜交(Northernblot),點雜交（dotblot）和原位雜交。二仙湯是治療婦女更年期綜合征、抗衰老的名方，具溫補腎陽、瀉相火、調(diào)沖任功能。廖柏松等［1］采用Northernblot對18月齡雌性大鼠下丘腦內(nèi)阿片肽的基因表達水平進行研究，結果表明，二仙湯組β內(nèi)啡肽前體阿黑皮素原和腦啡肽原的mRNA水平明顯升高，達到未衰老前水平。沈小珩等［2］則從衰老過程抗氧化酶活性降低，且酶活性降低與其蛋白質(zhì)基因表達水平降低平行的現(xiàn)象出發(fā)，采用分子雜交等技術考察二仙湯及其拆方對超氧化物歧化酶、過氧化氫酶基因表達水平及其活性的影響。結果表明，抗氧化酶活性顯著升高，且與其mRNA表達水平升高呈平行關系,提示二仙湯抗衰老是通過增強抗氧化酶基因表達水平而實現(xiàn)的。海風藤有祛風除濕、通經(jīng)活絡的功效。韓恩吉等［3］采用Northernblot觀察它對人類神經(jīng)母細胞瘤細胞系列淀粉樣前體蛋白(βamyloidprecursorprotein,βAPP)基因表達的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)，海風藤選擇性地抑制βAPP基因表達,為其防治阿爾茨海默病提供了一定依據(jù)。鄭欽岳等［4］應用dotblot研究了補血和血方四物湯對白細胞介素6（interleukin6，IL6）mRNA表達的影響，實驗表明,四物湯在0.01～1.00ng/mL濃度內(nèi)可使IL6mRNA的表達明顯增加。保心丸具有降脂、降低血漿內(nèi)皮素、抑制血小板聚集等作用。為進一步闡明保心丸抗實驗性動脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）的機理,樊永平等［5］用原位雜交技術研究內(nèi)皮素（endothelin，ET）和一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)在AS家兔主動脈壁的基因表達。結果證實，保心丸組ET1mRNA的表達較模型組低,而NOSmRNA較模型組高,提示保心丸調(diào)節(jié)血管內(nèi)源性NO和ET之間的平衡可能是其抗實驗性AS的機理之一。精制血府膠囊是血府逐瘀湯的化裁精簡方，其抗心肌缺血療效明顯優(yōu)于原方，為揭示其作用機制，證實其療效，王偉等［6，7］分別采用Northernblot和原位雜交等技術，研究其對于心肌缺血密切相關基因表達的影響，前者結果表明精制血府膠囊顯著提高缺血缺糖心肌細胞NOSmRNA表達水平，后者的精制血府膠囊組，ET1和內(nèi)皮素轉換酶（endothelinconvertingenzyme，ECE）1的mRNA表達較其它組明顯減少，且心肌細胞損傷也較其它組顯著減輕。因而推測精制血府膠囊可能是通過提高NOS表達、促進NO生成及抑制ET1、ECE1的基因表達，減少ET1生成，減輕其對心肌細胞的直接損傷，發(fā)揮保護心肌細胞的作用。

Northernblot是用來測量真核生物RNA的量和大小及估計其豐度的實驗方法，并可從大量RNA樣本中同時獲得這些信息，但需要大量的材料，受RNA降解影響大，敏感性低。dotblot的不足之處在于點于同一張膜上同樣的樣品雜交信號有時不穩(wěn)定，且一般要用純化的RNA樣品。原位雜交的優(yōu)勢在于可對組織細胞中的核酸進行精確定位。核酸分子雜交是分子生物學基本技術，隨著反轉錄聚合酶鏈式反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RTPCR）技術、差異顯示PCR（differentialdisplayPCR，DDPCR）、DNA陣列等優(yōu)勢技術的出現(xiàn)、逐漸成熟而應用漸增，近5年應用基本的分子雜交技術研究中藥作用機理的報道已少見。

2RTPCR技術

PCR是美國科學家Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，RTPCR是從RNA擴增cDNA拷貝的方法，即先將RNA反轉錄成cDNA，再用PCR擴增，使其敏感性大大提高，解決了dotblot或Northernblot中目的mRNA含量太低的問題，是目前中藥機理研究中最常用的分子生物學技術，從發(fā)表的文獻數(shù)量可以反映出來。

這方面的研究報道包括有Gumiganghwaltang(GMGHT)抗炎機制的研究，KIMSJ等［8］研究其在小鼠腹膜巨噬細胞中的抗炎機制，結果顯示，GMGHT以劑量依賴的方式降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactoralpha，TNFα）,IL6和環(huán)氧酶2mRNA表達水平，推測這是GMGHT減少炎癥的重要分子機制之一。為了闡釋二仙湯治療腎陽虛證的作用機理，鄭小偉等［9］考察了二仙湯不同時間對腎陽虛大鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophichormone，ACTH)基因表達的影響。結果是二仙湯可以上調(diào)垂體組織ACTH基因表達，且表達量隨用藥時間延長而增加，提示上調(diào)ACTHmRNA表達是二仙湯治療腎陽虛證的作用機理之一。β地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血病，補腎生血方具有補腎、益髓、生血作用，用于治療雜合子患者療效明顯。為揭示其分子機理，吳志奎等［10］采用RTPCR等技術考察了用藥者的α、β和γ珠蛋白mRNA轉錄水平。結果發(fā)現(xiàn)，補腎生血膠囊能明顯提高β地中海貧血患者血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和抗堿血紅蛋白（hemoglobinF），Hb珠蛋白鏈比增加，γ珠蛋白mRNA轉錄水平相應升高，說明補腎生血藥具有促進γ珠蛋白轉錄和表達，誘導HbF合成作用，代償了β珠蛋白基因的缺陷。益髓生血顆粒是補腎生血方的顆粒劑，易杰等［11］研究了其對β地中海貧血患者造血刺激因子干細胞因子（Stemcellfactor，SCF）及人紅細胞生成素受體（erythropoietinreceptor，EPOR）mRNA表達的影響。結果顯示，治療后,外周血EPOR、SCFmRNA表達明顯增強，因此推測益髓生血顆?？赡苁峭ㄟ^影響SCF以及EPORmBNA表達來促進骨髓造血,提高Hb、紅細胞的水平,達到治療β地中海貧血的目的。陳智松等［12-14］從此方的抗衰老及中醫(yī)腎生髓理論的角度出發(fā)，分別研究其對骨髓有核細胞中誘導細胞凋亡、促使機體衰老的原癌基因cmyc、抑制細胞凋亡的原癌基因Bcl2和造血刺激因子粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimutaingfactor，GMCSF)基因表達的影響。結果表明，衰老時高表達的骨髓cmyc，明顯降低的Bcl2和GMCSF，用藥后，前者表達水平明顯下降甚至不表達，后兩者表達明顯提高。因此認為補腎生血方通過抑制cmyc的表達，促進Bcl2表達，從而抑制骨髓細胞凋亡，延長細胞壽命，延緩了衰老，并結合有關的醫(yī)學成果，認為Bcl2和GMCSF是腎生髓的本質(zhì)相關基因。凌云彪等［15］研究清熱活血補益方(肝纖方)對大鼠肝臟Ⅰ型前膠原mRNA的表達和膠原酶活性的影響。結果表明,以清熱活血補益方制備的含藥血清抑制了Ⅰ型前膠原mRNA的表達，膠原酶的活性增加。提示此方抑制Ⅰ型前膠原mRNA的表達,減少膠原的合成,同時提高膠原酶的活性促進膠原的降解,可能是其抗肝纖維化的部分機制。此外，蔡晶等［16］通過檢測雌激素受體(estrogenreceptor，ER)α和βmRNA表達量，考察了補腎陽中藥淫羊藿和補腎陰中藥女貞子對雄性大鼠杏仁核和皮質(zhì)頂葉ERmRNA的調(diào)節(jié)表達差異,結果顯示，兩用藥組大鼠杏仁核、皮質(zhì)頂葉ERαmRNA表達量無明顯變化,ERβmRNA表達量都上調(diào)，且淫羊藿組高于女貞子組，說明補腎中藥可能是通過對ERβ的調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用。

RTPCR的獨特優(yōu)勢在于RNA純度不必很高，僅少量RNA模板即能滿足實驗所需，盡管實踐中RTPCR還遠達不到理論上能檢測到單一拷貝的RNA樣品的敏感度，但遠高于Northernblot。尤其適用于可獲得的mRNA數(shù)量有限和目的基因表達水平很低時測定基因表達的強度。只是擴增步驟中樣品間擴增效率的微小差異將極大地影響信號強度，使用內(nèi)參照可以減少這一問題，但無法徹底排除［17］?？偟膩碚f，RTPCR是測量RNA樣品中低豐度mRNA時的最佳方法。

3DDPCR技術

1992年，梁鵬等建立了一種對不同來源的mRNA樣品用PCR技術對其中許多的cDNA基因一起進行擴增和顯示的實驗方法，即DDPCR。該方法依賴2套不同類型的合成寡核苷酸引物：一套錨定反義引物與一套隨機正義引物。最后通過比較不同來源的擴增cDNA產(chǎn)物的電泳帶譜，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達的基因。

中藥作用機理研究中應用DDPCR的報道有唐發(fā)清等［18］對有抗鼻咽癌作用的益氣解毒片干預鼻咽癌細胞基因表達的研究，旨在從基因選擇性表達水平探討其抗鼻咽癌的機理。結果表明,益氣解毒片在體外能抑制鼻咽癌細胞基因的表達,同時誘導一些特異基因的表達,從而抑制鼻咽癌細胞的增殖。

相比以往的方法，DDPCR技術提供了幾方面理論上的優(yōu)勢，如理論上能夠靈敏地檢測組織或細胞中表達量極低的mRNA樣品的差異表達，能鑒別特定組織或細胞來源樣品之間轉錄水平的mRNA定性和定量變化。這種優(yōu)勢同樣可體現(xiàn)在中藥機理研究中，可同時顯示中藥作用后對多種基因轉錄的不同影響，將有影響的靶基因條帶回收，再擴增、克隆、測序，查詢確定是什么基因，是已知或未知序列，這樣就可以確定中藥起效可能源于影響那些基因轉錄。但這些優(yōu)勢目前部分還停留在理論上，還有許多技術問題有待解決，如經(jīng)DDPCR鑒定出來的超過半數(shù)的cDNA是假陽性條帶，靶細胞的總mRNA中的一部分不能被高水平擴增、造成丟失等［17］。盡管目前DDPCR應用在中藥基因轉錄水平的機理研究報道還很少，但毋庸置疑，其潛力巨大。

4DNA陣列技術

DNA陣列技術是新發(fā)展起來的可同時分析數(shù)千個基因表達譜的技術。其原理同核酸分子雜交。在不同的文獻中的稱謂不盡相同，如基因芯片、DNA芯片、微陣列等，目前沒有明確區(qū)分，通?；煊谩?/p>

目前有零散的采用商用或自制微陣列研究中藥基因表達水平的報道。如周聯(lián)等［19］采用含2048個基因的小鼠基因表達譜芯片檢測黃連解毒湯及其成分黃芩苷和鹽酸小檗堿對LPS造型的小鼠脾細胞基因表達的影響，結果復方的作用明顯優(yōu)于有效成分的作用，但對具體基因表達影響的分析存在一定難度。王廣良等［20］用自制的包含24個細胞周期相關基因的cDNA微陣列，對抑制肝癌細胞增殖的4種中藥烏藥、青蒿、紫草和黃芪的抗腫瘤分子機制研究表明，4種中藥對細胞周期基因和損傷檢測點基因均有不同程度改變,表現(xiàn)為部分上調(diào),部分下調(diào),通過分子生物學技術進一步驗證了用其治療癌癥的合理性。

在中藥作用機理研究中，DNA陣列技術可以同時對使用中藥前后的數(shù)千個基因表達情況進行比較和差異分析；且具有所需樣品的用量極少、自動化程度高、被測目標DNA密度高的優(yōu)點。但目前微陣列技術也存在許多問題，如其小型化和高通量的特點使得對外界和內(nèi)部的變動都很敏感，因此宜采用取平均值并標準化操作的辦法，但目前尚無普遍認可的規(guī)則和標準來指導微陣列實驗，數(shù)據(jù)采集和分析方法及操作系統(tǒng)也存在很大不同［17］。此外，基因表達與調(diào)控研究的滯后，使得中藥機理研究中獲得的很多信息難于解釋；昂貴的制作費用也是一個限制因素。

5展望

總體來講，中藥的作用機理研究應是多水平的，不僅包括基因轉錄水平，也包括轉錄后、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后水平的調(diào)控上，對每個特定的中藥/中藥復方，可能不一定在各水平上都有影響，基因轉錄水平的機理研究主要就是考察對相關靶基因mRNA水平的改變，也是目前分子生物學技術在中藥機理研究中的主要應用范疇。中藥尤其是中藥復方的多成分多功效決定了其很可能對基因轉錄水平有影響，已完成的研究結果已證明了這一點。

中藥的機理研究通過應用分子生物學技術已深入到幾乎是最根本的基因轉錄水平，并在該水平上對中藥的療效獲得了一定解釋，但整體上還處于探索階段。已有的研究主要是應用如核酸分子雜交、RTPCR技術等考察“單基因”的技術，應用如DDPCR、DNA陣列等研究多基因的技術的報道較少。中藥調(diào)節(jié)機體平衡的特點決定了對基因轉錄的影響很可能是對多基因的協(xié)同影響，如對補腎生血方的系列研究已表明此方的功效與影響EPOR、SCF、cmyc、Bcl2、GMCSF基因表達有關。因此，應用研究多基因表達的技術考察對多基因的協(xié)同影響將是未來中藥基因轉錄水平作用機理研究的主要方向。相信隨著現(xiàn)有技術的不斷發(fā)展和完善、新技術的出現(xiàn)及多種技術相結合加上疾病細胞分子水平研究的深入，復雜的中藥作用機理會逐步得到闡釋，中藥的療效和可能發(fā)現(xiàn)的新功效將從機理上獲得科學依據(jù)，為中藥獲得像西藥一樣的市場準入權提供有力的支撐。

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