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納米芯片快速檢測(cè)研究

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納米芯片快速檢測(cè)研究

標(biāo)準(zhǔn)品及緩沖液

HDL、低密度脂蛋白(LDL)、VLDL標(biāo)準(zhǔn)品及納米金(5、10、20nm,CASno.7440575)、Tricine、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二醇、甲醇、甲基葡胺均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。硝基苯并二唑C6酰基鞘氨醇(NBDC6ceramide)購(gòu)自美國(guó)MolecularProbes公司。超速離心制備lLDL(密度為1.020~1.044kg/L)、sdLDL(密度為1.044~1.063kg/L)[6]。40mmol/LTricine緩沖液(pH值9.8),含40mmol/L甲基葡胺、0.02mmol/L十二烷基硫酸鈉、20nmol/L納米金(5nm)。所有試劑均為分析純,配制試劑用水為二次蒸餾水。

臨床資料

CHD患者35例,其中男20例、女15例,年齡56~78歲,均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)有冠狀動(dòng)脈病變。正常對(duì)照組30名,男15名,女15名,年齡33~70歲,均排除心腦血管疾病。四、血清樣本的采集及預(yù)處理2μL血清加入4μL緩沖液,再加入2μL0.1g/LNBDC6ceramide(乙二醇∶甲醇=9∶1的混合液預(yù)先溶解)進(jìn)行避光預(yù)染,1min后加入25μL緩沖液,此為電泳待測(cè)樣本。

芯片電泳過(guò)程

將4μL檢測(cè)樣本加入試樣池,5μL緩沖液分別加入試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池,各電泳池插入電極。試樣池加+750V電壓,試樣廢液池接地,緩沖液池加+200V,緩沖液廢液池加+300V,進(jìn)樣40s后同時(shí)切換電壓進(jìn)入分離階段。分離階段緩沖液廢液池加0V,緩沖液池加+3100V,試樣池和試樣廢液池均施加+300V,運(yùn)行溫度25℃。分離電場(chǎng)強(qiáng)度為403V/cm。

納米金對(duì)脂蛋白分離的影響

芯片電泳分離混合的HDL標(biāo)準(zhǔn)品、VLDL標(biāo)準(zhǔn)品、lLDL和sdLDL,電泳圖譜見(jiàn)圖2。緩沖液中的納米金顆粒為5nm時(shí),脂蛋白各組分完全分離,當(dāng)納米金顆粒>5nm時(shí),脂蛋白分辨率降低,分離效率下降。圖3為緩沖液中不同濃度的納米金對(duì)脂蛋白分離度的影響。當(dāng)納米金濃度為20nmol/L時(shí),脂蛋白各組分之間實(shí)現(xiàn)基線分離。

芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白的對(duì)比

芯片電泳與瓊脂糖凝膠電泳分離同一健康體檢者血清脂蛋白,結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4(a)為脂蛋白瓊脂糖電泳圖譜,健康體檢者血清脂蛋白可分出3條區(qū)帶,分別為HDL、VLDL及LDL。圖4(b)為脂蛋白芯片電泳圖譜,電泳分離出4條特征峰,分別為lLDL、sdLDL、VLDL及HDL。相對(duì)于芯片電泳,瓊脂糖凝膠電泳分析時(shí)間長(zhǎng),分辨率不高,不能區(qū)分lLDL與sdLDL,而且LDL區(qū)帶容易拖尾。

線性范圍、檢測(cè)限和重現(xiàn)性

在優(yōu)化的分離條件下,lLDL、sdLDL、VLDL和HDL芯片電泳的線性范圍[信噪比(S/N)=3]分別為0.01~0.8、0.04~1.0、0.04~1.0、0.02~0.8mg/L;檢出限分別為5、5、15和8μg/L。對(duì)健康體檢者的血清樣本連續(xù)測(cè)定5次,lLDL、sdLDL、VLDL和HDL的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.5%、2.2%、4.5%、3.9%。

臨床樣本測(cè)定

對(duì)臨床確診的35例CHD患者和30名健康體檢者血清進(jìn)行芯片電泳分析。CHD組與健康對(duì)照組比較,sdLDL與VLDL峰面積顯著增加(P<0.01),HDL峰面積顯著下降(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

本文作者:汪驊1韓崇旭1王惠民2金慶輝3王大新1曹麗1董蘭梅1作者單位:1蘇北人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心2南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心3中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究

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